Le stress mécanique peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches, fournissant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Nous présentons un protocole pour induire la différenciation chondrogénique des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) en utilisant la gravité centrifuge (CG). La régulation positive de SOX9 induite par CG entraîne le développement de phénotypes chondrogéniques.
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Article de méthode
Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cartilage altéré ne peut pas guérir naturellement. Actuellement, la thérapie la plus avancée pour les défauts du cartilage est la transplantation de chondrocytes différenciés des cellules souches à l’aide de cytokines. Malheureusement, la différenciation chondrogénique induite par les cytokines est coûteuse, prend du temps et est associée à un risque élevé de contamination lors de la différenciation in vitro. Cependant, les stimuli biomécaniques servent également de facteurs régulateurs cruciaux pour la chondrogenèse. Par exemple, le stress mécanique peut induire une différenciation chondrogénique des cellules souches, suggérant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Dans cette étude, nous avons démontré que la gravité centrifuge (CG, 2 400 × g), une contrainte mécanique facilement appliquée par centrifugation, induisait la régulation positive de la région déterminante du sexe Y (SRY)-box 9 (SOX9) dans les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC), les amenant à exprimer des phénotypes chondrogéniques. Les ASC centrifugés ont exprimé des niveaux plus élevés de marqueurs de différenciation chondrogéniques, tels que l’aggrécan (ACAN), le collagène de type 2 alpha 1 (COL2A1) et le collagène de type 1 (COL1), mais des niveaux plus faibles de collagène de type 10 (COL10), un marqueur des chondrocytes hypertrophiques. De plus, la formation d’agrégats chondrogéniques, condition préalable à la chondrogenèse, a été observée dans les ASC centrifugés.
Introduction
Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d'altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l'acquisition d'un nombre suffisant de cellules souches et l'induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l'isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d'acquisition, le tissu ad....
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Protocole
Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC16EAME0162) et réalisée selon les directives du NIH. Tous les tissus ont été obtenus avec le consentement éclairé par écrit.
Chargement 1. centrifuge Gravité et Pellet Culture
- La culture cellulaire et la récolte
- ASCs de culture (P2-P3; voir la liste des matériaux) dans Modifié Moyennement bas de glucose de Eagle Dulbecco (DMEM-LG) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. ....
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Résultats
gravité centrifuge induit une surexpression de marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux.
Pour déterminer le degré de la force de gravité centrifuge qui est apte à induire la différenciation chondrogénique, ASCs ont été stimulées avec divers degrés de CG (0, 300, 600, 1200 et 2400 x g) pendant 15 min. Après stimulation, les ASCs ont été re-ensemencées sur des plaques de cul.......
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Discussion
L'état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l'expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu'à 3 passages 16. ASCs ont tendance à perdre l'expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG.
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Déclarations de divulgation
Nous déclarons que nous n’avons aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.
Remerciements
Cette recherche a été financée par une subvention du Projet coréen de R&D sur la technologie de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financée par le ministère de la Santé et du Bien-être social de la République de Corée (numéro de subvention : HI14C2116) et par le Fonds de recherche de l’hôpital St. Mary de Séoul, Université catholique de Corée.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| 100 mm Plat | TPP | 93100 | |
| 60 mm Plat | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Pipette jetable | Falcon | 7551 | |
| 5 mL | Falcon | 7543 | |
| ASC Milieux de culture Matériaux | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | milieu de base |
| de croissance Pénicilline Streptomycine | Sigma Aldrich | P4333 | 1 % |
| Fetal Bovin Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10 % |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Matériaux de différenciation chondrogénique | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | Milieu de base de différenciation chondrogénique |
| MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexaméthasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Pénicilline Streptomycine Life | Technologies | P4333 | 1 % |
| Fetal Bovin Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1 % |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μ ; g/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μ ; g/mL |
| ITS | BD | 1 % | |
| TGF&bêta humain ; 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4 % Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Sérum bovin Albumine | Vecteur Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagène II | anticorps abcam ; | ab34712 | 1:100 |
| Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 594 | Sonde moléculaire | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Sonde moléculaire | D1306 | |
| Prolong gold anti-fade | réactif Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroforme | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand kit de synthèse d’ADNc | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| Chargement étoile | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) Marqueur d’échelle d’ADN | Enzynomics | DM003 | |
| Cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux (ASCs) | Cellules MASTER catholiques |
Références
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al.
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Réimpressions et autorisations
