Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Zusammenfassung

Die Verwendung präklinischer Modelle zur Untersuchung der Tumorbiologie und des Ansprechens auf die Behandlung ist für die Krebsforschung von zentraler Bedeutung. Alteingesessene humane Zelllinien und viele transgene Mausmodelle versäumen es oft, die Schlüsselaspekte menschlicher Malignome zu rekapitulieren. Daher werden alternative Modelle entwickelt, die die Heterogenität der Tumoren und ihrer Metastasen besser abbilden. Patienten-abgeleitete Xenotransplantat-Modelle (PDX), bei denen chirurgisch resezierte Tumorproben in immungeschwächte Mäuse transplantiert werden, sind zu einer attraktiven Alternative geworden, da sie über mehrere Generationen transplantiert werden können und die Tumorheterogenität effizienter widerspiegeln als Xenotransplantate, die aus menschlichen Krebszelllinien stammen. Eine Einschränkung bei der Verwendung von PDXs besteht darin, dass sie schwer zu transfizieren oder zu transduzieren sind, um rückverfolgbare Reporter einzuführen oder die Genexpression zu manipulieren. Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Transduktion dissoziierter Tumorzellen aus PDXs mit hoher Transduktionseffizienz und die Verwendung von markierten PDXs für experimentelle Modelle von Brustkrebsmetastasen. Das Protokoll demonstriert auch die Verwendung von markierten PDXs in experimentellen Metastasenmodellen, um den Organbesiedlungsprozess der Metastasenkaskade zu untersuchen. Metastasen in verschiedenen Organen können mit Hilfe der biolumineszenten Bildgebung bei lebenden Tieren oder der GFP-Expression während der Dissektion und bei exzidierten Organen leicht sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Diese Methoden bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Verwendung mehrerer Arten von PDXs auf die Metastasierungsforschung auszuweiten.

Einleitung

Die Entwicklung von Patienten stamm Tumorxenografte (PDXs), wobei operativ reseziert Tumorproben direkt transplantiert werden in immungeschwächten Mäusen, bietet mehrere Vorteile gegenüber Standard - Zell-Linie Xenotransplantatmodellen und stellt einen großen Fortschritt in der Krebsforschung ^1,2. PDXs können durch aufeinanderfolgende Durchgänge mit minimalen Veränderung der genetischen und biologischen Eigenschaften des Tumors bei der ersten Passage gezüchtet gepflegt und erweitert werden; und genauer widerspiegeln Tumor Heterogenität als abgeleitet Xenotransplantate von menschlichen Krebszelllinien ^3-8. Diese Modelle werden nun in großem Umfan....

Protokoll

Alle Schritte folgt die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll erfordert die Richtlinien der University of Colorado Tierforschung Ethikkommission (IACUC).

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und andere Reagenzien

1. Herstellung von 100 ml mammosphere enthaltenden Medien Dulbeccos Modified Eagle Medium und Han F-12-Medium (DMEM / F12) (1: 1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, 20 ng / ml), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 10 ng / ml ), Heparin (4 & mgr; g / ml), 1x B27, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml). Machen Medien unter sterilen Bedingungen und lagern bei 4 ° C für bis zu 3 Monate.
2. Bereiten epithelial ....

Ergebnisse

Diese Methode beschreibt die Transduktion von PDX-dissoziierten Zellen Brustkrebs mit hohem Titer unter Verwendung von lentiviralen Vektoren pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro und Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W. Diese Vektoren exprimieren einen fluoreszierenden Marker, der die Effizienz der Transduktion in vitro ermöglicht die Abschätzung bereits 24 h nach der Infektion (Abbildung 1a). Für die meisten PDXs Expression von GFP wird 72 Stunden nach der Infektion (A.......

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls:

Die Verwendung hoch Titer Lentivirale Partikel (> 10 ⁸ TU / ml) ist ein entscheidender Schritt in den Erfolg dieses Protokolls, die sorgfältige Kontrolle der während der in vitro Transduktion Medienzusammensetzung ermöglicht. Während mehrere Methoden für die Herstellung von High-Titer viralen Partikel wurden gut ^18,19 beschrieben; Dieses Protokoll verwendet lentivirale Partikel , wie im Detail in .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM/F12 (1:1)	Hyclone	SH30023.01
bFGF	BD Biosciences	354060
EGF	BD Biosciences	354001
Heparin	Sigma	H4784
B27	Gibco/Thermo Fisher	17504-44
Anti-Pilz-Antibiotika	Hyclone	SV30010
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105-500	Aufschlusspuffer
FBS	Atlanta Biologicals	S11550
HBSS Rot Ca2+/Mg2+freier	Hyclone	SH30031.02
Hepes
10x PBS	Hyclone	SH30258.01
Cultrex	Cultrex	3433-005-01	Grundstein-Matrix-Extrakt (BME)
30 ° C-Schüttler	NewBrunswick Scientific CO. INC	Serie 25 Inkubator-Schüttler
70 μ m Filter	Falcon	7352350
Skalpelle	Fisher	22079690
Clorhexidin Desinfektionsmittel	Durvet	NDC# 30798-624-35
Reagenz für die Zelllyse von rotem Blut	Sigma	R7757
Neuraminidase	Sigma	N7885-1UN
EpCAM (CD326+) Mikrokügelchen*	Miltenyil Biotec	130-061-101
Kit zur Depletion von Abstammungszellen, Maus	Miltenyil Biotec	130-090-858
MiniMACS Separator	Miltenyil Biotec	130-042-102
Mini MACS Magnetständer	Miltenyil Biotec	130-042-303
MS Säulen	Miltenyil Biotec	130-042-201 MS-	oder LS-Säulen können verwendet werden, einstellbar auf die Anzahl der Zellen.
Illumatool Abstimmbares Lichtsystem	Lightools research	Verschiedenes	Für die in vivo Fluoreszenzbildgebung
Xenogen IVIS200 Bildgebungsgerät	Xenogen	Verschiedenes	Für die in vivo Luminiszenzbildgebung
Humanes Cytokeratin Klon MNF116 Monoklonaler Antikörper	DAKO	M0821	Pan-Cytokeratin
Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor-Antikörper	Zellsignalisierung	4267S	EGFR

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