Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.
हम मध्य कान में विशिष्ट दवा वितरण के लिए कृन्तकों में दो न्यूनतम इनवेसिव microsurgical तकनीक मौजूद है, ताकि यह भीतरी कान तक पहुंच सकता है। पहली प्रक्रिया मध्य कर्ण बुल्ला, करार दिया bullostomy के छिद्र होते हैं; दूसरा एक transtympanic इंजेक्शन है। दोनों मानव नैदानिक intratympanic प्रक्रियाओं का अनुकरण।
Chitosan-glycerophosphate (CGP) और Ringer's लैक्टेट बफर (आरएल) स्थानीय दवा वितरण के लिए biocompatible वाहनों के रूप में इस्तेमाल किया गया। CGP एक nontoxic biodegradable बहुलक व्यापक रूप से दवा अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है। यह आरटी पर एक चिपचिपा तरल है, लेकिन यह शरीर के तापमान पर एक अर्द्ध ठोस चरण के लिए congeals। आरएल एक isotonic मनुष्यों में नसों में प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया समाधान है। इस वाहन की एक छोटी मात्रा ठीक एक bullostomy के माध्यम से दौर विंडो (आरडब्ल्यू) आला पर रखा गया है। एक transtympanic इंजेक्शन मध्य कान भरता है और कम नियंत्रण है, लेकिन भीतरी कान के लिए व्यापक उपयोग की अनुमति देता।
<p clasएस = "jove_content"> दोनों तकनीकों की सुरक्षा के प्रोफाइल का अध्ययन किया और कार्यात्मक और रूपात्मक परीक्षण का उपयोग करके तुलना की गई। सुनवाई से पहले श्रवण brainstem रिस्पांस (ABR) और microsurgery के बाद कई बार दर्ज द्वारा मूल्यांकन किया गया था। कर्णावत संरचनाओं के cytoarchitecture और संरक्षण के स्तर paraformaldehyde-तय की और decalcified कर्णावत नमूनों में पारंपरिक ऊतकीय तकनीक द्वारा अध्ययन किया गया। समानांतर में, unfixed कर्णावत के नमूने ले जाया गया और तुरंत मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर) द्वारा भड़काऊ मार्करों के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए जमे हुए।दोनों प्रक्रियाओं, माउस मध्य कान में दवा वितरण के तरीकों के रूप में उपयुक्त हैं, हालांकि transtympanic इंजेक्शन bullostomy की तुलना में कम आक्रामक साबित हुई।
सुनवाई हानि सबसे लगातार मानव संवेदी घाटा (है और दुनिया भर में जनसंख्या का 5.3%, और 65 साल की उम्र से अधिक व्यक्तियों के 30% को प्रभावित करता है http://www.who.int/topics/deafness/en अद्यतन 2016,)। नुकसान सुनकर बच्चों में भाषा के अधिग्रहण को प्रभावित करता है और पुराने लोगों में संज्ञानात्मक गिरावट accelerates। इसलिए, यह एक जबरदस्त सामाजिक-आर्थिक प्रभाव के साथ एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य देखभाल समस्या है। यह आनुवंशिक दोष, पर्यावरणीय कारकों या दोनों 1, जो अंत में कोक्लीअ में नुकसान और बालों की कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की मौत के लिए प्रेरित का एक संयोजन की वजह से हो सकता है। इन कोशिकाओं को पुनर्जीवित स्तनधारियों में नहीं है, इसलिए सेलुलर घटाने और सहवर्ती सुनवाई हानि के उलट नहीं किया जा सकता है। नैदानिक विकल्प सुनवाई एड्स और कर्णावत, मध्य कान और हड्डी चालन प्रत्यारोपण 2 सहित कृत्रिम उपकरणों, पर आधारित हैं। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई विशेष चिकित्सा दृढ Trea हैंऔर हानि सुनवाई के लिए tments इस प्रकार कई अनुसंधान लाइनों निवारक और विरोहक उपचारों के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। उपन्यास चिकित्सीय विकल्प औषधीय चिकित्सा 2 के लिए जीन और सेल उपचार के साथ-साथ छोटे अणुओं का विकास शामिल है।
कर्णावत औषधीय चिकित्सा में सबसे महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक दवा वितरण है। प्रणालीगत उपचार रक्त-भूलभुलैया बाधा 3 के कारण कोक्लीअ में प्रभावकारिता सीमित है, कर्णावत रक्त वाहिकाओं, जो भीतरी कान तरल पदार्थ homeostasis बनाए रखने के लिए है, इसलिए भीतरी कान के लिए दवा पारित होने को सीमित करने के लिए एक भौतिक और जैव रासायनिक बाधा के रूप में कार्य करता है के साथ संपर्क में निरंतर endothelium। यह केवल छोटे liposoluble अणुओं के लिए पारगम्य है, हालांकि पारगम्यता मूत्रल या आसमाटिक एजेंटों के उपयोग के साथ कर्णावत सूजन के दौरान बढ़ाया जा सकता है, और भी। दवा है कि अंततः कोक्लीअ के बाद प्रणालीगत प्रशासन कम हो जाता है पहुँचता है की मात्रा;इसलिए, उच्च खुराक है कि जैविक विषाक्तता का कारण बन सकता आवश्यक हैं। इसके अलावा, दवा के यकृत चयापचय विषाक्त या निष्क्रिय चयापचयों 4, 5, 6, 7 का उत्पादन कर सकते हैं। इसके विपरीत, स्थानीय हस्तक्षेप अवांछनीय दुष्प्रभाव 4, 7, 8, 9 के बिना मध्य या भीतरी कान में दवा की एक ज्ञात सीमित मात्रा की नियुक्ति की अनुमति देते हैं। वर्तमान नैदानिक अभ्यास में, intratympanic प्रशासन ऐसे Meniere रोग 10 में जेंटामाइसिन के रूप में कुछ कर्णावत विकृतियों, के लिए सीमित कर रहे हैं, अचानक बहरापन में corticosteroids, Meniere रोग, प्रतिरक्षा की मध्यस्थता और शोर प्रेरित सुनवाई हानि, 11, 12, 13, 1अचानक बहरापन 4, 16, 17 में 4, 15 और इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक 1 (IGF1)।
स्थानीय प्रशासन के लिए योगों कर्णावत तरल पदार्थ की नाजुक समस्थिति (पीएच और परासारिता) की रक्षा करनी चाहिए। इसके अलावा, यह प्रक्रिया के दौरान बाँझपन बनाए रखने के लिए मस्तिष्कमेरु द्रव के जीवाणु संक्रमण से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया excipient biocompatible, nonototoxic और उचित स्थिरता का होना चाहिए। तरल समाधान Eustachian ट्यूब के माध्यम से क्लीयरेंस के कारण intracochlear इंजेक्शन के लिए सिफारिश की है, लेकिन intratympanic मार्ग के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इस मामले में, दवाओं को आम तौर पर अर्द्ध ठोस जैल द्वारा किया जाता है मध्य कान 4, 18, 19 में अपने स्थायित्व बढ़ाने के लिए। वैकल्पिक वितरण systeभीतरी कान के लिए दवा के पारित होने में वृद्धि करने के वाहक के रूप में इस्तेमाल किया एमएस नैनोकणों 20 कर रहे हैं और 21 adenoviruses यहाँ हम दो वाहनों की तुलना में: CGP और एक आर एल समाधान। CGP एक हाइड्रोजेल chitosan द्वारा गठित एक रेखीय polysaccharide डी-glucosamine और एन एसिटाइल-D-glucosamine जलीय गोले से प्राप्त किया, और β-glycerophosphate, एक polyol कि chitosan चेन चारों ओर पानी की एक ढाल रूपों और में यह कहना है से बना है तरल रूप। CGP थर्मल है और मध्य कान 22, 23, 24, 25 में निरंतर दवा रिहाई की इजाजत दी, lysozymes द्वारा अपमानित किया जा सकता है। Chitosan आधार हाइड्रोजेल प्रतिरक्षाजनकता और स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 23, 24 के सक्रियण की कमी की कमी के कारण इस तरह के दवा वितरण के रूप में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त वाहनों रहे हैं। अन्य संगठनों परएर हाथ, आर एल बफर, पानी और इलेक्ट्रोलाइट्स का एक स्रोत के रूप में एक गैर pyrogenic isotonic समाधान (273 mOsm / एल और पीएच 6.5) मनुष्यों में नसों में प्रशासन के लिए इरादा है, विशेष रूप से खून की कमी, मानसिक आघात या क्योंकि लैक्टेट चयापचय के उपोत्पाद चोटों जला जिगर में एसिडोसिस प्रतिक्रिया।
यहाँ हम वर्णन है और दो शल्य चिकित्सा पद्धतियों कि माउस भीतरी कान के लिए स्थानीय दवा वितरण के लिए परिष्कृत किया गया है की तुलना करें। दोनों तकनीकों की सुरक्षा प्रोफाइल, कार्यात्मक रूपात्मक और आणविक परीक्षण का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। सुनवाई श्रवण brainstem रिस्पांस (ABR), 26, 27 से पहले और अलग अलग समय पर microsurgery के बाद प्रदर्शन का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। अंत बिंदु प्रक्रियाओं कोक्लीअ काटना और इन दोनों प्रक्रियाओं के microsurgical, संरचनात्मक सेलुलर और आणविक प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया।
भीतरी कान के लिए स्थानीय दवा वितरण सीधे intracochlear इंजेक्शन द्वारा या परोक्ष रूप से intratympanic प्रशासन द्वारा किया जा सकता, मध्य कान 4, 19, 39 में दवा रखकर। Intracochlear प्रशासन नियंत्रित प्रदान करता है और कोक्लीअ के लिए सटीक दवा वितरण, खिड़की झिल्ली के माध्यम से प्रसार से परहेज है, बेसल करने वाली शिखर एकाग्रता ढ़ाल और निकासी Eustachian ट्यूब के माध्यम से। हालांकि, यह आमतौर पर एक अत्यधिक आक्रामक प्रक्रिया है कि एक जटिल और नाजुक microsurgery 7, 39 की आवश्यकता है। इस संदर्भ में, उद्योग नए, लेपित, निरंतर दवा रिहाई 40, 41 के लिए प्रत्यारोपण उपकरणों विकसित कर रहा है। दूसरी ओर, intratympanic प्रशासन एक न्यूनतम इनवेसिव और प्रदर्शन करने के लिए आसान प्रक्रिया है कि डी की बड़ी मात्रा के इंजेक्शन की अनुमति देता हैमध्य कान में गलीचा, हालांकि फार्माकोकाइनेटिक्स नियंत्रित करने के लिए आसान नहीं है। दवा के बहुमत Eustachian ट्यूब के माध्यम से मंजूरी दे दी है और शेष अंश कोक्लीअ 18 तक पहुंचने के लिए आरडब्ल्यू झिल्ली के माध्यम से फैलाना है। आरडब्ल्यू कोक्लीअ 7 की perilymph से भरे मध्य कर्ण नली में मध्य कान से पदार्थों की अधिकतम अवशोषण की साइट है। यह एक semipermeable तीन परत संरचना है, हालांकि इसकी पारगम्यता दवा विशेषताओं (आकार, एकाग्रता, घुलनशीलता और बिजली के प्रभारी) पर और transmembrane परिवहन व्यवस्था (प्रसार, सक्रिय परिवहन या phagocytosis), 42 पर निर्भर करता है। अंडाकार खिड़की और कान का कैप्सूल कोक्लीअ 43, 44 के लिए विकल्प नहीं है लेकिन कम प्रभावी प्रवेश द्वार हैं।
यहाँ हम प्रदर्शन और माउस मध्य कान में लक्षित दवा वितरण के लिए दो microsurgical तरीकों की तुलना: bullostomy और transtympaएनआईसी इंजेक्शन प्रक्रियाओं। इन प्रक्रियाओं के लिए आम महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: i) सुनवाई के मूल्यांकन से पहले और microsurgery के बाद, द्वितीय) बाँझ शर्तों के तहत एक सजातीय वाहन समाधान की तैयारी, iii) संवेदनाहारी प्रक्रिया और पशुओं के शरीर का तापमान और स्थिरांक की निगरानी के सावधान पर्यवेक्षण, चतुर्थ ) वाहन आरडब्ल्यू को निशाना बनाने का उचित मात्रा की धीमी गति से नियुक्ति, और चतुर्थ) कर्णावत के नमूने लेने के आणविक और रूपात्मक विश्लेषण पूरा करने के लिए।
Bullostomy के लिए Retroauricular और उदर दृष्टिकोण वर्णित किया गया है 7, 45। क्योंकि हमारे अनुभव में यह कम रुग्णता में हुई और आरडब्ल्यू 46 के लिए बेहतर उपयोग प्रदान की गई है हम उदर सन्निकटन इस्तेमाल किया। Transtympanic इंजेक्शन आमतौर पर Pars कान की झिल्ली की Tensa के माध्यम से बाहर किया जाता है, कान में की हड्डी manubrium से 12 पूर्वकाल या पीछे। मेंयह काम हम इंजेक्शन के दौरान हवा निकासी की अनुमति देने के Pars Tensa के पिछले अतिरिक्त पंचर के साथ कान में की हड्डी से परे Pars flaccida के माध्यम से तकनीक, एक इंजेक्शन के एक संशोधन का प्रदर्शन किया।
transtympanic इंजेक्शन कम पश्चात आरोग्यलाभ बार और कोई रुग्णता के साथ, bullostomy से कम आक्रामक था, हालांकि दोनों microsurgeries थे तेजी (20 और 5 bullostomy और transtympanic दृष्टिकोण क्रमशः के लिए कान प्रति मिनट)। सबसे महत्वपूर्ण बात, दोनों प्रक्रियाओं सुनवाई बनाए रखा और ABR मापदंडों के microsurgery से पहले निर्धारित उन लोगों के लिए समान थे। transtympanic दृष्टिकोण bullostomy की तुलना में कम समय लगता है और एक ही हस्तक्षेप के दौरान एक ही पशु के दोनों कानों में प्रदर्शन किया जा सकता है। transtympanic इंजेक्शन के लाभ इस प्रकार हैं कि यह, यदि जरूरी हुआ तो द्विपक्षीय किया जा सकता है और दोहराया। दूसरी ओर, bullostomy आरडब्ल्यू झिल्ली के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है दृश्य और filli की अनुमति देता हैआरडब्ल्यू आला की एनजी। इसके विपरीत, transtympanic इंजेक्शन आरडब्ल्यू आला में वाहन स्थापन के नियंत्रण के लिए अनुमति नहीं है।
प्रक्रियाओं इस काम में सूचना दी कि कैसे इस तरह के नुकसान की सुनवाई में ototoxicity और प्रभावकारिता के मूल्यांकन के मूल्यांकन के रूप में पूर्व नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मध्य कान के लिए एक स्थानीय दवा वितरण वाहन प्रदर्शन करने का वर्णन है। दो microsurgery प्रक्रियाओं का वर्णन किया है कि विशिष्ट फायदे और कमियों के साथ वैकल्पिक तरीकों प्रदान कर रहे हैं। दोनों सुनवाई के संरक्षण और रूपात्मक परिवर्तन का कारण नहीं है। स्थानीय सूजन bullostomy का एक संभावित जटिलता के रूप में वर्णन किया गया है। पूरक तकनीकों का एक सेट भी सुनवाई, रूपात्मक और भड़काऊ मार्कर अभिव्यक्ति के मूल्यांकन सहित postsurgical प्रक्रियाओं, के लिए वर्णित हैं। इन तकनीकों के लिए भविष्य अनुप्रयोगों, आनुवंशिक सेलुलर और औषधीय दृष्टिकोण सहित नुकसान, श्रवण, पशु मॉडल में के लिए नए उपचारों के preclinical मूल्यांकन में शामिल हैं। Intratympanic administratआयनों, मध्य कान में उपचार के वितरण सुनिश्चित दौर खिड़की झिल्ली के साथ संपर्क में, स्पष्ट कर्णावत क्षति के बिना perilymph में पारित होने की सुविधा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक अपनी तकनीकी सहायता के लिए जीनोमिक्स और noninvasive Neurofunctional मूल्यांकन सुविधाएं (IIBM, CSIC-UAM) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम स्पेनिश "Ministerio de अर्थशास्त्र Y Competitividad" (फेडर-SAF2014-53979-आर) और यूरोपीय संघ (FP7-AFHELO और FP7 लोगों के बीच-TARGEAR) IVN के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
Water pump | Gaymar | # TP472 | |
Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
Statistics software (SPSS) | IBM | ||
Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer |
Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour. |
Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
Pividone iodine based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
Microlance 27G | Becton Dickinson | # 302200 | |
Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
Catheter (Microfil 34G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |