جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
الخلايا الجذعية (DCS) هي الخلايا العارضة للمستضد المتخصصة أهم من نظام المناعة لدينا. غير ناضجة البلدان النامية (البلدان الجزرية النامية) يقيمون في الجلد أو في الأنسجة المخاطية وبالتالي هي من بين الخلايا المناعية الأولى للتفاعل مع مسببات الأمراض الغازية. وتمثل البلدان النامية الجسر بين الفطرية ونظام المناعة التكيفية 1، لأنها يمكن أن تفعيل البائية والخلايا الردود التالية الكشف عن العوامل المسببة للأمراض. وعلاوة على ذلك، لأنها تسهم في الاستجابات المناعية الموالية للالتهابات بسبب إفراز كميات عالية من السيتوكينات، مثل IL-1β، IL-6، و IL-12. البلدان النامية أيضا تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية وجذب الخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الإصابة التي كتبها الكيميائي.
ويمكن تقسيم البلدان النامية إلى خلايا غير ناضجة شجيري (البلدان الجزرية النامية) والخلايا الجذعية الناضجة (mDCs) 2 بناء على التشكل وظيفة. بعد الاعتراف مستضدات الخارجية من جانب واحد من العديد من مستقبلات التعرف على الأنماط (على سبيل المثال، مثل عدد المستقبلات، C-نوعيكتينس، أو تكمل مستقبلات) أعرب بوفرة على سطح الخلية، البلدان الجزرية النامية تخضع لتغييرات كبيرة وتبدأ في النضج. وخلال هذه العملية النضج، ومستقبلات لالتقاط مستضد وأسفل تنظيم، في حين أن جزيئات أساسية لتقديم المستضد ويصل ينظم 3. ناضجة البلدان النامية يصل تنظيم معقد التوافق النسيجي الكبير الأول والثاني (MHC الأول والثاني)، وشارك في تنشيطية الجزيئات مثل CD80 و CD86، التي تعتبر ضرورية لتقديم المستضد وتنشيط الخلايا اللمفاوية التائية. بالإضافة إلى ذلك، هو فعل للتعبير عن CCR7 مستقبلات chemokine على سطح الخلية، والتي تمكن من الهجرة من البلدان النامية من الأنسجة الطرفية إلى الغدد الليمفاوية. وسهلت الهجرة من قبل "المتداول" من البلدان النامية على طول يجند chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) وchemokine يجند 21 (CCL21 / SLC) التدرج إلى الغدد الليمفاوية 4-6.
وبعد الهجرة، mDCs تقديم المستضد تجهيزها لالسذاجة خلايا CD4 + و CD8 + T، وبالتالي رسائل كتبها هذا المؤلفtiating استجابة مناعية التكيف ضد الغازي الممرض 7. ويرتبط هذا التفاعل مع الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية أيضا مع انتشار الفيروس 8. وكشفت الدراسات في المختبر الأخرى التي البلدان النامية التقاط بكفاءة ونقل فيروس نقص المناعة البشرية إلى خلايا T وأن هذه النتائج انتقال الى عدوى نشطة 9-12. هذه التجارب تبرز أن في الجسم الحي فيروس نقص المناعة البشرية يستغل البلدان النامية كما المكوكات من المحيط إلى الغدد الليمفاوية. خلال تقديم المستضد، البلدان النامية تفرز المحفزة الرئيسية التي تحدد شكل التفريق بين المستجيب الخلايا التائية المساعدة، وبالتالي، يتم تحديد نتائج الاستجابة المناعية كلها ضد ميكروب في هذا التفاعل جدا. وبصرف النظر عن نوع 1 (TH1) والنوع 2 (TH2) المستجيب الخلايا التائية، مجموعات فرعية أخرى من الخلايا CD4 + T المساعدة (على سبيل المثال، اكتب 17 (Th17) ونوع 22 (خلايا Th22) T) وقد وصفت، وتحريض و وقد تم التحقيق في وظيفة تماما. وتشارك البلدان النامية علاوة على ذلك فيتوليد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) 13،14. هذه الخلايا هي المثبطة للمناعة، ويمكن أن تتوقف أو أسفل تنظم تحريض أو انتشار المستجيب خلايا تي وحاسمة لتطوير مناعة والتسامح وهكذا.
وتضم البلدان النامية التقليدية الإنسان (جان تنمية المجتمعات المحلية) عدة مجموعات فرعية من الخلايا مع الأصل النخاعي (أي خلايا لانغرهانس (خطابات الاعتماد) والجلد والبلدان النامية الخلالي) أو أصل اللمفاوية (أي البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS)). لفي التجارب المختبرية أو استراتيجيات التطعيم العاصمة، وتستخدم البلدان النامية الوحيدات المستمدة بشكل روتيني نموذجا للبلدان النامية عن طريق الجلد. تظهر هذه الخلايا التشابه في علم وظائف الأعضاء، مورفولوجيا، وظيفة الخلايا الجذعية الدم النخاعي التقليدية. يتم إنشاؤها من قبل إضافة انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة بلعم تحفيز مستعمرة عامل (GM-CSF) إلى حيدات معزولة من المتبرعين الأصحاء 12،15-18. ويمكن أيضا أن الخلايا الجذعية تكون معزولة مباشرة من الجلد أو الغشاء المخاطي الخزعات، أو يمكن حتى به وضعت من CD34 + الخلايا الاصلية المكونة للدم المعزولة من عينات دم الحبل السري التي تم الحصول عليها الرحم السابقين. هنا، علينا أن نظهر كيف يتم عزل حيدات وحفز من الدم البشري مكافحة متخثر بعد خلية وحيدة النواة في الدم المحيطي (PBMC) تخصيب بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 5 أيام، وحيدات الإنسان في ظل ظروف محددة هي متباينة في البلدان الجزرية النامية ونحن على استعداد لإجراءات تجريبية في وضع غير سريري.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (MDDCs) من خلال عزل حيدات الإنسان من الدم المضادة للمتخثر باستخدام الفحص القائمة على جسيمات متناهية الصغر المغناطيسي. في هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ الخطوات الطرد المركزي المنبع الإجراء العزلة الخلية، مم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
