Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
Dendritiska celler (DC) är de viktigaste specialiserade antigenpresenterande celler av vårt immunsystem. Omogna DC (IDC) bor i huden eller i slemhinnevävnader och är därför bland de första immunceller att interagera med invaderande patogener. DCs representerar bron mellan det medfödda och adaptiva immunsystemet 1, eftersom de kan aktivera T- och B-cellsvar efter detektion av patogener. Dessutom bidrar de till proinflammatoriska immunsvar på grund av utsöndring av höga mängder av cytokiner, såsom IL-1β, IL-6, och IL-12. DCs aktivera även NK-celler och locka andra immunceller till platsen för infektion av kemotaxi.
DCs kan delas in i omogna dendritiska celler (IDC) och mogna dendritceller (MDCS) 2 baserat på deras morfologi och funktion. Efter erkännandet av främmande antigener genom en av de många mönsterigenkänningsreceptorer (t.ex. vägtullliknande receptorer, C-typlektiner, eller komplettera receptorer) rikligt uttryckt på cellytan, IDC genomgår stora förändringar och börjar mogna. Under denna mognadsprocessen, receptorer för antigen capture är nedregleras, medan molekyler som är viktiga för antigenpresentation är uppreglerad 3. Mogna DCs dig reglera histokompatibilitetskomplex I och II (MHC I och II), samstimulerande molekyler som CD80 och CD86, som är väsentliga för antigenpresentation och aktivering av T-lymfocyter. Dessutom är uttrycket av kemokinreceptorn CCR7 på cellytan induceras, vilket möjliggör migration av DC: er från perifera vävnader till lymfkörtlarna. Migreringen underlättas av "rullande" av DC: er längs en kemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) och kemokin ligand 21 (CCL21 / SLC) gradient till lymfkörtlarna 4-6.
Följande övergångs, MDCS presentera den bearbetade antigenet till naiva CD4 + och CD8 + T-celler, vilket således initiating ett adaptivt immunsvar mot den invaderande patogenen 7. Denna interaktion med T-celler i lymfkörtlarna är också förknippat med spridningen av viruset 8. Andra in vitro-studier visade att DC fångar effektivt och överföra HIV till T-celler och att denna transmission resulterar i en kraftig infektion 9-12. Dessa experiment markera att in vivo HIV exploits DCs som skyttlar från periferin till lymfkörtlarna. Under antigenpresentation, DCs utsöndrar viktiga interleukiner som formar differentieringen av effektor-T-hjälparceller, och därför är resultatet av hela immunsvar mot mikroben bestäms vid denna mycket interaktion. Bortsett från typ 1 (Th1) och typ 2 (Th2) T-celler, andra undergrupper av CD4 + T-hjälparceller (t.ex. typ 17 (Th17) och typ 22 (Th22) T-celler) har beskrivits, och deras induktion och funktionen har undersökts grundligt. DCs är vidare involverade igenerering av regulatoriska T-celler (tregs) 13,14. Dessa celler är immunsuppressiva och kan stoppa eller nedreglera induktion eller proliferation av T-celler och är därför avgörande för att utveckla immunitet och tolerans.
Mänskliga konventionella DC (CDCs) omfattar flera undergrupper av celler med en myeloid ursprung (dvs Langerhans celler (LCS) och huden och mellan DCS) eller en lymfoidursprung (dvs plasmacytoid DCs (pDCs)). För in vitro-experiment eller DC vaccinationsstrategier, är monocythärledda DCs rutinmässigt används som en modell för dermala DC. Dessa celler visar likheter i fysiologi, morfologi och funktion till konventionella myeloida dendritiska celler. De genereras genom tillsats av interleukin 4 (IL-4) och granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) till monocyter isolerade från friska givare 12,15-18. Dendritiska celler kan också direkt isoleras från dermala eller mukosala biopsier, eller kan även be utvecklats från CD34 + hematopoetiska progenitorceller isolerade från navelsträngsblodprover erhållna ex livmodern. Här visar vi hur monocyter isoleras och stimuleras av anti-koagulerat humant blod efter perifert blod mononukleära celler (PBMC) anrikning av densitetsgradientcentrifugering. Efter inkubation under 5 dagar, humana monocyter på vissa villkor är differentierade i IDCs och är redo för experimentella procedurer i en icke-klinisk miljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver generering av monocythärledda dendritiska celler (MDDCs) genom isolering av humana monocyter från anti-koagulerat blod med hjälp av en magnetisk nanopartikel-baserad analys. I detta protokoll är de centrifugeringsstegen utförs uppströms cellen isoleringsförfarandet, vilket leder till en anrikning av PBMC-fraktionen. Även om celler går förlorade under centrifugeringen, för att överlagra innehållet i ett helblod pack på densitetsgradient mediet skulle kräva 200-300 ml av densitetsg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
