Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
apoptoz ile ölen hücreler, aynı zamanda komşu canlı hücrelerin fonksiyonunu etkileyen sağlayacak birçok yeni faaliyetler kazanmak gibi düzenlenmiş hücre ölümü anılacaktır. Böyle hayatta kalma, proliferasyon, büyüme ve farklılaşma gibi hayati faaliyetler, apoptotik hücreler tarafından modüle birçok hücresel fonksiyonları arasında yer almaktadır. apoptotik hücrelere tanıyıp tepki yeteneği bağımsız olarak soy veya bağlantı organının, tüm hücrelerin evrensel özellik olarak görünmektedir. Ancak, çeşitlilik ve büyük bir dikkatle herhangi bir sonuç için sorumlu sinyal olaylarını ve yollar diseksiyon alınması apoptotik hücreler görev tepki karmaşıklığı. Özelde, bir apoptotik hücreler de dahil olmak üzere, uygun bir cevap hücreleri içinde hücre içi sinyal yollarını etkileyebilir olan çoklu mekanizmalar arasında ayrım yapılmalıdır: reseptör aracılı apoptotik hücre tanınması, apoptotik hücre tarafından çözülebilen aracıların salınmasını ve / veya etkileşim phagocytic makine. Burada, apoptotik hücrelere maruz kaldıkları aşağıdaki canlı yanıt veren hücrelerde uyarılan hücre içi sinyal olayları tanımlamak için bir protokol sağlar. protokolün önemli bir avantajı apoptotik hücrelerin yanıt hücreleri içinde sinyal olaylarını modüle hangi mekanizmanın diseksiyonu için ödediği dikkat yatıyor. Protokol bir şartlı immortalize fare böbreği proksimal tübüler hücre hattı (BU.MPT hücreleri) için spesifik iken, kolayca kaynaklı olmayan epitel ve / veya böbrek dışında organ türetilmiş olan hücre hatlarına uyarlanmıştır. Bir uyarıcı olarak ölü hücrelerin kullanımı hücre içi sinyal olayları algılama engelleyebilir birçok benzersiz faktörler tanıtır. Bu sorunlar, hem de bunları en aza indirmek veya aşmak için stratejiler, protokolde içinde tartışılır. Bu protokolün uygulanması sağlığında ve Disea hem de ölü veya ölmekte hücreler canlı komşuları üzerinde uygulamayın geniş etki genişleyen bilgi yardımcı olmalıdırse.
Introduction
Apoptozis veya regüle hücre ölümü 1, dokuların bakımı ve geliştirilmesi için önemli bir şekilde katkıda bulunur. En basit inceledi, apoptoz izinleri, yaş hasarlı veya aşırı hücre çevredeki dokulara 2,3 zarar vermeden bertaraf edilmesi için. doku homeostazında için apoptoz katkısı, önemli ölçüde daha dinamik ve çeşitlidir. Apoptoz ile ölmemiştir hücreler birden fazla yeni aktiviteler elde hem salgılanan hem hücre-bağlantılı bitişik canlı hücreler 4-10 çalışmasına etki sağlayacak. Inflamasyonu 11-16 bastırmak için apoptotik hücrelerin yeteneği odaklanmış önceki çalışmalar, ancak apoptotik hücreler de, hayatta kalma 4,9,10, çoğalması 4,9,10, farklılaşma 17 gibi hayati faaliyetler de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonları, geniş bir modüle göç 18 ve büyüme 19. Ayrıca, bu etkiler makrofaj gibi -profesyonel fagositlerin sınırlı değildirs, ancak epitelyal ve endotelyal hücreleri 7,9,10,18-21 gibi geleneksel fagositik olmayan hücreler de dahil olmak üzere, hemen hemen tüm hücre tipleri ve soy, kadar uzanır.
apoptotik hücrelere maruz kaldıktan sonra, bitişik canlı hücre spesifik yanıt uygulanabilir, hücrelerin ve apoptotik hücrelerin kendileri, hem ilgili çok sayıda faktöre bağlıdır. Apoptotik hücrelere maruz kalmanın sıçangil makrofaj ve böbrek proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (PTECs) proliferasyonunu inhibe olmasına rağmen, örneğin, bu iki hücre tipi apoptotik hücrelerin 4,6,9,10 onların yaşam yanıt olarak büyük ölçüde farklılık gösterir. Apoptotik hücreler, makrofajlar yaşamasını uzattığı ancak PTECs 4,6,9,10 apoptotik ölümüne neden olur. Özellikle, apoptotik hücrelere yanıt aynı soydan gelen hücrelerin yanıt kökeni 10 (meme epitel karşı, örneğin böbrek PTECs nedeniyle yanıt hücrenin organa bağlı arasında bile farklılık gösterebilirhücreleri) ya da aktivasyon durumu 22 (örneğin, nötrofiller). Bunun aksine, apoptotik hücrelerin apoptotik doğasına bağlı olarak aynı hücre içinde farklı tepkiler 10,23 veya apoptoz 10,14 aşamasına uyaran tetikleyebilir.
Apoptotik hücre yanıtı diverseness ve karmaşıklığı göz önüne alındığında, büyük bir dikkatle herhangi bir sonuç sorumlu sinyal olaylarını ve yolların kesme alınmalıdır. İlk olarak, canlı ve apoptotik hücreleri arasındaki doğrudan fiziksel etkileşim gerektiren yanıtları apoptotik hücrenin 3,6-10 tarafından yayımlanan veya oluşturulan çözünür arabulucular tarafından ortaya çıkarılan olanlardan ayırt edilmelidir. Fiziksel etkileşim gerekli ise, o zaman, bir başka farklılaşma yapılmalıdır. Sinyal olayları apoptotik hücre bağlanan özel bir reseptör bağımsız sonra yutulma bağımsız veya fagositik alımına apoptotik hücre, reseptör aracılı tanıma bağlıdır 3-7,9,10,19. İkinci durumda, tepki apoptotik hücrelere özgü değildir ve herhangi bir fagositik malzeme 4,6 ile tetiklenebilir.
Bu ayrımlar önemi tekrar makrofajlar ve böbrek PTECs tepkileri zıt tarafından takdir edilebilir. Her iki hücre türü için, apoptotik hücrelerine maruz ön-sağkalım kinaz Akt'nin aktivitesini değiştirir. Modülasyon, bir 0.4 um polikarbonat membran ile yanıt ayrılması ve apoptotik hücre yana yanıt 4,9,10,19 ortadan kaldırır, fiziksel etkileşime bağlıdır. Makrofajlar tepki fagositozu 4,9,10,19 tarafından tahrik edilmektedir, oysa Ancak PTECs tepkisi, reseptör aracılı fagositoz bağımsızdır. Bu sonuç, lateks boncuklar, nötr fagositik uyarana, maruz kalınması hiçbir PTECs içinde Akt aktivitesi üzerine etkisi, ancak taklit makrofajlar 4,9 apoptotik hücrelerin etkisi vardır gerçeği ile takviye edilmiştir.
"Daha az araştırılmıştır> de, nekroz ya da kaza sonucu hücre ölümü 1 ile boyama hücreleri apoptotik hücre gibi, nekrotik hücre çeşitli mekanizmalar, özellikle sızıntı yoluyla etki gösterirler. 3-10,19 Yakınlarda canlı hücrelerin fonksiyonunu modüle onların yırtılmış hücre zarından 3,5,6,9,24 aracılığıyla hücre içi içeriğinin. PTECs ve makrofajlar dahil olmak üzere birçok hücreler, hücreler nekroz 5,9 ile ölen için farklı olmayan rakip reseptörlerini sahiptirler. bu reseptörlerin Nişan olan sinyal olaylarını neden olur apoptotik hücreler, fosforilasyon 9,10,19 azaltılması ise genellikle apoptotik hücrelerin 4-10,19 reseptörlerinin katılım neden kişilerce karşısında yer alır. Örneğin, PTECs olarak, nekrotik hücre, Akt fosforilasyonunun artar.Burada, komşu apoptotik PTECs reseptör aracılı tanınması yoluyla uygulanabilir böbrek PTECs indüklenen hücre içi sinyal olaylarını belirlemek için bir protokol açıklar <sup> 9,10,19. Protokol BU.MPT hücreleri 9,10,19,25,26 olarak bilinen bir şartlı immortalize PTEC hücre hattı için özel olsa kolayca kaynaklı olmayan epitel ve / veya daha başka organlara türetilmiş olan hücre hatlarına uyarlanmıştır böbrek. Önemlisi, bir hücre uyarıcı olarak apoptotik hücrelerin kullanımı çözünür ligandlar ile mevcut olmayan bazı doğal deneysel zorluklar teşkil etmektedir. Bunların en önemlisi, apoptotik hücrelerin bir süspansiyon olarak yerine bir çözelti olarak ilave edilebilir olmasıdır. Bu zorluklar, hem de bunları en aza indirmek veya aşmak için stratejiler, protokolde içinde tartışılır. Neredeyse protokolün açıklanan tekniklerin tüm basit ve hücre kültürüne standarttır. Bu protokolün avantajı apoptotik hücreler yanıt hücrelerin içinde sinyal iletimini modüle hangi birden mekanizmaları dikkatini yatıyor. Bu mekanizmalar yüzey belirleyicileri yoluyla bağlanması veya yeniden spesifik reseptörlere molekülleri köprü dahilsponding hücre, çözünür mediatörlerin salınımı ve / veya fagositik makine nişan. Nekrotik hücrelerinin sonuçları hücre ölümü modunda olup ölü hücreler için genel yanıtı özgü olduğundan emin olmak için tüm deneylere dahil edilmiştir. Bu protokol önerildiği gibi dikkatli bir yaklaşım, ölen hücrelerin sağlığı ve hastalıkları hem de, onların canlı komşuları üzerinde uygulamayın sürekli genişleyen etki anlayışımıza çok önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada apoptoz veya hücre ölümünün diğer formları uygulanan hücrelere maruz kalma sonra yaşayabilir hücrelerin indüklenen hücre içi sinyal olayları için bir protokol sağlar. protokol apoptotik hücrelere maruz canlı cevap veren hücreler içinde hücre içi sinyal yollarını modüle hangi birden fazla mekanizmalar vurgulamaktadır. Bu mekanizmalar, şunları içerir: bir etkileşim (ölü hücre ya da atkı aralığı veziküller ve microvesicles ilgili moleküller veya yüzey belirleyicilerini köprü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
