При болезни Паркинсона (PD), черной субстанции (ВНС) дофаминергические нейроны дегенерируют, что приводит к моторной дисфункции. Здесь мы сообщаем протокол для культивирования вентральных нейронов среднего мозга от мыши, выражающей EGFP с приводом от Тирозингидроксилаза (TH) промоторной последовательности, собирая отдельные флуоресцентные нейроны из культур, и измеряя их транскриптом с использованием Секвенирование РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
При болезни Паркинсона (БП) широко распространена потеря нейронов по всему мозгу с выраженной дегенерацией дофаминергических нейронов в ВНС, что ведет к Брадикинезия, ригидности и тремора. Идентификация живых дофаминергических нейронов в первичных Брюшной мезенцефалической (VM) культур с использованием флуоресцентного маркера обеспечивает альтернативный способ изучить избирательная уязвимость этих нейронов, не полагаясь на иммунное фиксированных клеток. Здесь мы изолируем, диссоциируют, и культура мыши VM нейроны в течение 3 недель. Затем определить дофаминергических нейронов в культурах с использованием EGFP флуоресценции (направляемый Тирозингидроксилаза (TH) промотор). Отдельные нейроны собирают в микропробирок с использованием стекла микропипетки. Далее, мы лизировать собранные клетки, а также проводить синтез кДНК и транспозонов-опосредованной "tagmentation" для получения однородной клеточной РНК-Seq библиотеки 1, 2,попка = "Xref"> 3, 4, 5. После прохождения проверки контроля качества, библиотеки одноклеточные упорядочиваются и последующий анализ проводится для измерения экспрессии генов. Мы сообщаем Транскриптом результаты для отдельных дофаминергической и ГАМКергических нейронов, выделенных из среднемозговых культур. Мы сообщаем, что 100% живых клеток TH-EGFP, которые были собраны и секвенированию дофаминергические нейроны. Эти методы будут иметь широкое применение в неврологии и молекулярной биологии.
Введение
Болезнь Паркинсона (БП) является неизлечимым, связанная с возрастом нейродегенеративное расстройство. Причина этого довольно распространенным заболеванием остается плохо изученным. Существует широкое потеря нейронов по всему мозгу, с выраженной дегенерации нейронов дофаминергических нейронов в черной субстанции (ВНС), что приводит к диагностических клинических признаков Брадикинезия, жесткости и тремора.
Первичные смешанные культуры, содержащие дофаминергических нейронов SNc особенно важны для лечения болезни Паркинсона. Брюшной тегментальной Площадь (VTA) дофаминергических нейронов были вовлечены в награду и наркомании. Брюшной мезенцефа....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию животных, предоставленных Национальным институтом здоровья и протоколы были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения из Калифорнийского технологического института.
1. Получение первичной дофаминергической культур клеток из мозга эмбриона мыши
- Решения и культура Средние
- Приготовление аскорбиновой кислоты маточного раствора
- Взвешивают 352 мг аскорбиновой кислоты. Добавить стерильного H 2 O до конечного общего объема 20 мл. Место в C водяной бане 37 ° до рас....
- Приготовление аскорбиновой кислоты маточного раствора
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы сообщаем протокол для культивирования вентральных нейронов среднего мозга от мыши , выражающей EGFP , приводимый промоторной последовательностью тирозин гидроксилазы, собирая отдельные флуоресцентные нейроны из культур, и измерения их РНК - транскриптом с использованием Секвенирование РНК (рисунок 1). Данные показали, что 100% -ом-EGFP-позитивных клеток, которые были собраны и секвенированию дофаминергические нейроны, основанные на присутствии следующих трех DA-.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы выделяем отдельные клетки из гетерогенной популяции с использованием флуоресцентной метки, а затем изучить каждую клетку с одноклеточного Секвенирование РНК. Мы сообщаем, что 100% живых клеток TH-EGFP, что мы заготовленной и секвенированию, в самом деле дофаминергические нейроны, основанные на присутствии следующих трех DA-связанных генных транскриптов, TH, DDC и SLC6A3. Все положительные клетки TH-EGFP выразил эти три гена, как оценивали с помощью РНК-Seq. Это была созвучна с электрофизиологических исследовани.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Национальных институтов здравоохранения США (DA017279, AG033954, DA037743), Фонда Майкла Джей Фокса и Инициативы инноваций Калифорнийского технологического института, финансирующей Лабораторию генетики и геномики Милларда и Мюриэль Джейкобс в Калифорнийском технологическом институте. Мы благодарим Брайана Уильямса за оптимизацию протокола библиотеки RNA-Seq и за оказанную помощь. Мы благодарим Генри Амрайна за компьютерное обучение. Мы благодарим Барбару Дж. Уолд за использование ее оборудования и лабораторного пространства. Мы благодарим Игоря Антошечкина за библиотечную последовательность и за управление объектами.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Папаин | Уортингтон Биохимическая корпорация | ||
| Сбалансированный по Хэнксу солевой раствор (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Донорская сыворотка для лошадей | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Среда: Нейробазальная среда | Gibco | 21103-049 | |
| Питательные среды, содержащие стабилизированную форму L-глютамина, L-аланил-L-глутамина: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | Конечная концентрация 0,5 мМ. |
| L-аскорбиновая кислота | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x стоковый раствор, 1x конечная концентрация. |
| Посуда со стеклянным дном 35 мм | MatTek | P35GC-1,5-10-C | |
| Поли-L-орнитин | сигма | P4957 | |
| Ламинин | Сигма | L2020 | Хранение при -20 °°; C в 20 & микро; L aliquots |
| Deoxyribonucrelative I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Синие наконечники для пипеток P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 мм неглубокая чашка | Петри VWR | 25384-324 | |
| 37 ° C Водяная баня | |||
| 37 °°; C, инкубатор с влажностью | |||
| 16% параформальдегид (PFA) | Электронная микроскопия Sciences | 15710 | |
| Тритон Х-100 | Сигма | X100-500ML | |
| Сыворотка осла | Equitech | SD-0100HI | 100% стоковый раствор, 1% конечная концентрация. |
| Хирургические ножницы стандартного образца | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Щипцы - 2x3 зуба | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Щипцы - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Щипцы - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7,4 | Gibco | 70011-044 | |
| Фосфатно-буферный раствор Дульбекко (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 мл |
| 21 G игла | BD PrecisionGlide Игла | 305167 | 100 игл |
| Микропипетка для вытягивания | Sutter Instrument | модель P-87 | |
| Микроманипулятор | Саттер Инструмент | Набор для секвенирования MP-285 | |
| : набор SMARTer со сверхнизким уровнем РНК для секвенирования Illumina | Clontech | 634936 | 100 rnxs, включая набор |
| олигонуклеотидов Advantage2PCR (12 и микро; M): олигонуклеотид SMARTer IIA (12 & микро; m) | Из комплекта SMARTer | ||
| Обратная транскриптаза (100 единиц) | Обратная транскриптаза | SMARTcribe из набора SMARTer | |
| Грунтовка 1 | 3' CDSIIa Праймер | Из набора SMARTer | |
| Kit Праймер 2 | IS ПЦР праймер | Из набора SMARTer | |
| 50x 2 полимеразная смесь | 50x Advantage 2 полимеразная смесь | Из набора SMARTer | |
| 10x PCR буфер | 10x Advantage 2 PCR буфер | из набора SMARTer | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| штатив для охладителя PCR | IsoFreeze PCR | ||
| Набор для подготовки образцов ДНК | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 образца |
| ПЦР мастер микс | Nextera ПЦР мастер микс (NPM) | Из набора Nextera | |
| Коктейль из праймеров для ПЦР (PPC) | Коктейль из праймеров Nextera PCR (PPC) | Из набора Nextera | |
| Флуориметр | Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS Набор биоанализатора ДНК | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Система электрофореза | Биоанализатор Agilent 2100. | G2938C | |
| Магнитные бусины: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 мл |
| РНКаза салфетки: РНКаза Zap салфетки | Ambion | AM9786 | Размер 100 листов |
| Qubit ds HS Набор для анализа | Молекулярные зонды | Q32854 | 500 анализов |
| Набор для экстракции геля: Qiaquick Набор для экстракции геля | Qiagen | 28704 | |
| Трубка стеклянная капиллярная ( | Kimax-51, наружный диаметр 1,5 - 1,8 мм) | ||
| Микрокузница | Narishige (или аналог) | ||
| Секвенсор | Illumina HiSeq instrument GENSAT | ||
| тирозингидроксилаза-eGFP мышиный штамм | Номер акции MMRRC: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Региональный исследовательский центр мутантных мышей |
Ссылки
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
