Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

Summary

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

I mitocondri svolgono ruoli importanti nel metabolismo energetico cellulare, particolarmente usando ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP). Essi sono implicati nella morte cellulare ed in numerose malattie umane. Mitocondriale fosforilazione ossidativa (OXPHOS) combina trasporto degli elettroni lungo la catena di trasporto di elettroni con il consumo di ossigeno e la sintesi di ATP. L'acido ciclo (TCA) mitocondriale tricarbossilici è coinvolto nella conversione di proteine, carboidrati e grassi in composti ricchi di energia come dinucleotide nicotinamide adenina (NADH) e flavina adenina dinucleotide (FADH _2). Gli elettroni del NADH e _FADH2 vengono poi trasferiti ai respiratori di trasporto degli elettroni complessi proteici catena (da I a IV) che si trova nella membrana mitocondriale interna. Inoltre, altri due percorsi redox possono trasferire elettroni elettroni catena di trasporto: i) mitocondriale elettron-trasferimento flavoproteina (ETF) che si trova sulla faccia matrice del mito internomembrana mitocondriale, e fornisce elettroni da acidi grassi β-ossidazione; e ii) deidrogenasi mitocondriale glicerofosfato che ossida glicerofosfato di diidrossiacetone fosfato e alimenta gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriale. IV Complesso (accettore di elettroni finale) trasferisce elettroni ad una molecola di ossigeno, la conversione di ossigeno a due molecole di acqua. Spostamento degli elettroni dal respiratoria complessa catena di trasporto degli elettroni da I a IV è accoppiato con il flusso di protoni dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrane che stabilisce un gradiente elettrochimico attraverso la membrana mitocondriale interna. In seguito, mitocondriale complesso V (ATP sintasi) navette gli ioni idrogeno indietro nella matrice mitocondriale e sintetizza molecole di ATP. Funzione OXPHOS può essere valutata in vivo e in vitro utilizzando varie tecniche e vari stati respirazione mitocondriale può essere ottenuto. In mitocondri isolati seguente influenzantistati Ry possono essere misurati: i) basale respirazione mitocondriale (stato 1), ii) il consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di substrati specifici delle mitocondriale complessi della catena respiratoria (stato 2), iii) massimo consumo di ossigeno mitocondriale dopo l'aggiunta di saturare concentrazioni di adenosina difosfato (ADP) (stato 3) e, iv) riposo respirazione dopo il consumo ADP (convertito in ATP) (stato 4). In cellule intatte le seguenti stati respiratorie possono essere misurati: i) basale consumo di ossigeno cellulare in presenza di substrati endogeni e ADP, ii) basale consumo di ossigeno cellulare in presenza di oligomicina (oligomicina-insensitive respirazione) e oligomicina sensibili respirazione (ATP turnover), iii) FCCP respirazione disaccoppiata, e iv) la respirazione mitocondriale non dopo l'aggiunta di antimicina A e rotenone. Nelle cellule permeabilizzate, substrati specifici dei complessi della catena di trasporto degli elettroni e ADP possono essere aggiunti e massimi complessi-dipendente frequenza respiratoria such I- così complesso, II e frequenza respiratoria IV-dipendenti può essere misurata.

Le misurazioni della respirazione cellulare forniscono importanti intuizioni capacità respiratoria mitocondriale specifico a complessi I-IV, integrità mitocondriale e metabolismo ^{1, 2, 3} energia. Uno dei dispositivi che consentono misurazioni del consumo di ossigeno mitocondriale con elevata precisione, risoluzione e sensibilità è la oxygraph ad alta risoluzione ^4. Il dispositivo ad alta risoluzione oxygraph contiene due camere con fori di iniezione e ciascuna camera è dotata di un sensore di ossigeno polarografico. sospensioni mitocondriali cellulari o isolate si mescolano continuamente nel respirometro. Per valutare la funzione mitocondriale, substrati e inibitori per l'attività mitocondriale complesso può essere aggiunto in seguito protocolli standard. Substrati e inibitori possono essere titolati per int iniezioneo le camere del oxygraph, e tassi di consumo di ossigeno sono calcolati utilizzando il software ed espresso in picomoli al secondo per numero di cellule. Ad alta risoluzione respirometria offre diversi vantaggi rispetto ai dispositivi di elettrodi di ossigeno polarografico tradizionali e convenzionali, tra cui una maggiore sensibilità e la capacità di lavorare con un piccolo numero di campioni biologici come le cellule intatte o permeabilizzate. Inoltre, ogni dispositivo contiene due camere, e frequenza respiratoria può essere registrato contemporaneamente per il confronto di concentrazioni di ossigeno. Il oxygraph ad alta risoluzione ha anche il vantaggio di una ridotta perdita di ossigeno dalle camere del dispositivo rispetto ai dispositivi elettrodo ossigeno polarografiche tradizionali. Un altro dispositivo recentemente sviluppato per misurare il consumo di ossigeno cellulare è il 96 pozzetti extracellulare analizzatore di flusso ^5. L'analizzatore di flusso extracellulare è equipaggiato con fluorescenza invece di sensori polarografiche. I vantaggi del extracellulareanalizzatore di flusso rispetto al oxygraph ad alta risoluzione sono i) è un dispositivo fortemente automatizzate, ii) è possibile misurare il consumo di ossigeno in 24 e piastre a 96 pozzetti per lo screening ad alta produttività, quindi richiedono minori quantità di campioni biologici, e iii) misurazione supplementare del flusso glicolitico cellulare è possibile. Gli svantaggi del analizzatore di flusso extracellulare in confronto al oxygraph ad alta risoluzione sono i) i costi elevati del dispositivo e di materiali di consumo come piatti fluorescenti, che sono a perdere, e ii) solo quattro composti per saggio / pozzetto sono iniettabili pertanto il sistema non è fattibile per i protocolli di titolazione substrato-disaccoppiatore-inibitori.

Nel presente studio, usiamo ad alta risoluzione respirometria per determinare la respirazione mitocondriale. Per gli esperimenti di consumo di ossigeno cellulari, le cellule vengono permeabilizzate per consentire l'ingresso di ADP esogeno e substrati mitocondriali ossidabili per alimentare elettroni in complexes del sistema respiratorio. Questo approccio consente la dissezione dei singoli complessi mitocondriali capacità respiratoria, che è un vantaggio rispetto alle cellule intatte (molti substrati sono cellule impermeant). Tuttavia, permeabilizzazione della membrana cellulare interromperà la barriera tra citosol e lo spazio extracellulare e medio (lavare di soluti citosolico) e la composizione dello spazio intracellulare è equilibrata con il mezzo extracellulare. Uno degli svantaggi di cellule permeabilizzate oltre cellule intatte è che la membrana esterna mitocondriale può essere danneggiato se eccessivo consumo di detersivo sono impiegati durante permeabilizzazione cellulare. In cellule intatte, basale, la respirazione accoppiata e disaccoppiata di cellule intatte può essere misurata. Questo metodo valuta il consumo di ossigeno delle cellule intatte senza l'aggiunta di substrati esogeni e ADP, riproducendo la funzione respiratoria nella cella integrato e fornendo anche informazioni sulla massima transpo elettroni mitocondrialeCapacità rt ^{6, 7.} Uno dei vantaggi di cellule intatte oltre cellule permeabilizzate è che ambiente cellulare non interrompere e mitocondri sono in contatto con le intere componenti delle cellule. Per permeabilize membrana plasmatica cellulare, detergenti tipo digitonina sono stati utilizzati ^8. Tuttavia, l'integrità della membrana mitocondriale esterna può essere compromessa se vengono impiegate quantità eccessive di digitonina. Per confermare che l'integrità della membrana esterna mitocondriale non è compromessa in cellule permeabilizzate, titolazione digitonina viene eseguito per determinare la concentrazione ottimale per permeabilizzazione cellulare. Per questi esperimenti, le cellule sono risospese in terreno respirazione e concentrazione digitonina viene titolato mediante respirometria in presenza di substrati mitocondriali e ADP e tassi di respirazione vengono misurate. La respirazione di cellule intatte, non permeabilizzate non è stimolata in presenza di mitochosubstrati ndrial e ADP. Tuttavia, la successiva titolazione graduale digitonina produrrebbe graduale permeabilizzazione delle membrane plasmatiche, e la concentrazione digitonina ottimale si ottiene. Ciò è dimostrato dall'incremento della respirazione fino a completa permeabilizzazione. Qualità mitocondriale e l'integrità della membrana esterna possono essere verificate con l'aggiunta di esogeno citocromo c ^{2, 9.} Citocromo c è un 12 kDa elettroni proteina di trasporto della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni ^{10, 11, 12.} Esso è localizzato nello spazio intermembrana mitocondriale ed è coinvolta nel consumo di ossigeno, portando elettroni complesso III complesso IV. Una volta che la membrana esterna mitocondriale è danneggiato, citocromo c viene rilasciato, e il consumo di ossigeno mitocondriale è ridotta. Dopo aggiunta di esogeno citocromo c, qualsiasi aumento nella respirazione mitocondriale è indicativo di unperturbato membrana mitocondriale esterna.

Nelle cellule permeabilizzate, substrati e inibitori della complessa attività mitocondriale sono aggiunti in seguito vari protocolli di ^{3, 9.} Ad esempio per investigare la frequenza respiratoria mitocondriale complessi-driven, il seguente protocollo può essere utilizzato. Dopo permeabilizzazione delle cellule, prima del complesso è stimolata dal substrati malato e glutammato, che generano NADH come substrato per la catena respiratoria e provocare l'attivazione del complesso I. Successivamente, ADP viene aggiunto per la conversione di ATP (stato 3, attiva complesso I-dipendente la respirazione). Una volta raggiunto un segnale stabile, rotenone (complesso mitocondriale I inibitore) viene somministrato per inibire complesso I. rotenone è seguito da succinato a _FADH2 e per attivare complesso II (stato 3, attiva complesso respirazione II-dipendente). Per misurare la respirazione complesso IV-dipendente, primo complesso IIIrespirazione -dipendente è inibita aggiungendo antimicina A (mitocondriale complesso III inibitore). In seguito, la respirazione complesso IV-dipendente è stimolata con la somministrazione di acido ascorbico e tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD può auto-ossidare nel buffer respirazione, quindi la massima complesso IV-dipendente frequenza respiratoria (stato 3) viene calcolato sottraendo i tassi di respirazione prima e dopo l'aggiunta di sodio azide, un inibitore del complesso mitocondriale IV. Gli esperimenti respirazione possono essere effettuate in due camere di un oxygraph in parallelo uno che serve come un controllo (cellule non stimolate), altre contenenti le cellule stimolate. Ovviamente, le cellule possono essere pretrattate in vari modi, ad esempio, con farmaci che agiscono funzioni mitocondriali, prima del loro consumo di ossigeno viene misurata nella camera oxygraph. Questo protocollo permette esame funzionale dei singoli complessi della catena respiratoria mitocondriale. Inoltre, si può misurare ADP-stimolata massimarespirazione (stato 3) di cellule permeabilizzate, utilizzando acido grasso esogeno in forma di palmitato. In questo protocollo, le scorte concentrati di palmitato di sodio sono coniugati con acidi grassi ultra libero albumina sierica bovina (BSA) (6: 1 rapporto molare palmitato: BSA). Successivamente, le cellule sono prima permeabilizzate con la respirazione mitocondriale e digitonina è valutata mediante aggiunta di carnitina e palmitato seguita da aggiunta di ADP (stato 3, la respirazione massima). Poi, si aggiunge oligomicina per imitare stato 4 (4o stato) e il rapporto di controllo respiratorio (valore di RCR) è calcolato come stato 3 / stato 4o. β-ossidazione promuove la produzione di acetil CoA (che entra nel ciclo TCA) e la generazione di _FADH2 e NADH, gli elettroni che sono passati alla catena di trasporto degli elettroni da flavoproteina elettrone-trasferimento e β-idrossiacil-CoA deidrogenasi. I mitocondri sono al centro del metabolismo degli acidi grassi e descritti protocollo palmitato-BSA può essere utilizzato dai ricercatori esaminando grassoty ossidazione degli acidi. In cellule intatte, attivatori e inibitori dell'attività mitocondriale complesso sono aggiunti seguendo un protocollo differente ^{6, 9.} Per questi esperimenti, prima del consumo di ossigeno di cellule non permeabilizzate in assenza di substrati esogeni viene misurata (fosforilazione frequenza respiratoria). Quindi, la frequenza respiratoria non fosforilante viene misurata dopo l'aggiunta di oligomicina, che è un inibitore della mitocondriale ATP sintasi. In seguito, il protonophore carbonile cianuro p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) è amministrato a varie concentrazioni e la frequenza respiratoria mitocondriale disaccoppiato massima viene misurata. Protonophores come FCCP possono indurre un aumento della permeabilità protonica della membrana interna, permettendo il movimento passivo di protoni per dissipare il gradiente chemiosmotica. Un aumento della permeabilità protone disaccoppia respirazione ossidativa (senza produzione di ATP) e induce un aumento oil consumo xygen. In seguito, rotenone e antimicina A sono aggiunti per inibire la respirazione mitocondriale, e la respirazione mitocondriale non viene sottratto da tutti gli altri tassi respiratori.

I tassi di consumo di ossigeno possono essere espressi come IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 cellule] (flusso di ossigeno per milione di celle) che è calcolato dividendo flusso di ossigeno specifico volume (in ossigeno camera chiusa), JV, O ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1] di concentrazione cellulare nella camera celle (numero di cellule per volume [10 ⁶ cellule ∙ ml ^{1]) 15.} Cell-massa del flusso di ossigeno specifico, JO ₂ [pmol x sec ^-1 x mg ^-1], è il flusso per cella, IO ₂ [pmol x ^sec-1 x 10 ^-6 celle], divisi in massa per cella [mg ∙ 10 ⁶ celle]; o il volume specifico flusso, JV, O ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1], diviso in massa per volume [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ è il flusso di ossigeno per proteina cellulare, peso secco o volume cellulare.

Nel presente studio utilizzando ad alta risoluzione respirometria, descriviamo i protocolli per determinare i) concentrazione ottimale digitonina per la completa permeabilizzazione della membrana plasmatica cellulare (test di titolazione digitonina), ii) l'integrità della membrana mitocondriale esterna utilizzando esogeni citocromo c, iii) mitocondriale complessi della catena respiratoria I , II e IV frequenze respiratorie massimi in cellule HepG2 permeabilizzate con digitonina in presenza di ADP esogeno e substrati catena respiratoria mitocondriale, e iv) basale, accoppiati e massima respirazione disaccoppiato (massima capacità di trasporto degli elettroni) di cellule intatte senza l'aggiunta di substrati esogeni e ADP, riproducendo la funzione respiratoria nella cella integrata.

Protocol

Cultura 1. cellulare Cellule Culture epatoma HepG2 umano 6 su 25 cm 2 fiasche di coltura cellulare in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) contenente siero 10% inattivato al calore bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in un incubatore (5% CO 2, 95% di aria) (densità di semina: 1 x 10 6 cellule ogni 25 cm pallone di coltura cellulare 2, tempo di incubazione in incubatrice a 37 ° C: 48 hr, densità delle cellule a…

Representative Results

Determinazione ottimale Digitonina concentrazione per Cellular Permeabilizzazione: Digitonina Titolazione Experiment Digitonin titolazione viene eseguita per determinare la concentrazione ottimale per permeabilizzazione delle cellule HepG2. Per questi esperimenti, digitonina viene titolato in cellule intatte in presenza di rotenone, succinato (mitocondriale complesso II substrato) e una quantità saturante di ADP (per indurre sta…

Discussion

L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di usare ad alta risoluzione respirometria per misurare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ci sono alcuni passaggi critici all'interno del presente protocollo. Primo, i tassi di consumo di ossigeno cellulare sono generalmente normalizzati per il numero…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical