अग्ंयाशय प्रत्यारोपण के लिए माउस मॉडल एक संशोधित कफ तकनीक का उपयोग
Summary
उदर ठोस अंग प्रत्यारोपण के बीच, अग्नाशय भ्रष्टाचार गंभीर ischemia reperfusion चोट से जुड़े भ्रष्टाचार के नुकसान को विकसित करने के लिए प्रवण हैं, जल्दी भ्रष्टाचार नुकसान के लिए अंततः अग्रणी । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक murine अग्ंयाशय ट्रांसप्लांटेशन के एक मॉडल का उपयोग कर एक गैर टांका कफ तकनीक, आदर्श इन जल्दी विश्लेषण के लिए उपयुक्त, बचके नुकसान ।
Abstract
माउस मॉडल ट्रांसप्लांटेशन अनुसंधान में कई फायदे हैं, आसान हैंडलिंग सहित, आनुवंशिक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित उपभेदों की एक किस्म है, और आणविक जांच और रिएजेंट की व्यापक रेंज की उपलब्धता के साथ ही vivo में प्रदर्शन करने के लिए इन विट्रो पढ़ाई । विभिंन murine ट्रांसप्लांटेशन मॉडल के साथ हमारे अनुभव के आधार पर, हम के इरादे से चूहों में एक heterotopic अग्ंयाशय प्रत्यारोपण मॉडल विकसित गंभीर ischemia reperfusion चोट-संबद्ध जल्दी भ्रष्टाचार के नुकसान से जुड़े तंत्र का विश्लेषण । पहले बताया सीवन तकनीक का उपयोग तकनीक के विपरीत, के साथ साथ हम एक नई प्रक्रिया का वर्णन एक गैर सीवन कफ तकनीक का उपयोग कर ।
हाल के वर्षों में, हम एक समग्र सफलता दर के साथ चूहों में अधिक से अधिक ३०० अग्ंयाशय प्रत्यारोपण प्रदर्शन किया है > 90%, एक सफलता की दर माउस अग्ंयाशय ट्रांसप्लांटेशन में पहले कभी नहीं वर्णित है । इस गैर की रीढ़-भ्रष्टाचार revascularization के लिए कफ तकनीक सीवन दो प्रमुख कदम होते हैं: (I) एक पॉलीथीन पर प्राप्तकर्ता पोत खींच/पॉलियामाइड कफ और यह एक circumferential संयुक्ताक्षर के साथ फिक्सिंग, और (II) दाता पोत पर रखकर umbilicus प्राप्तकर्ता पोत और यह एक दूसरे circumferential संयुक्ताक्षर के साथ फिक्सिंग । endothelial परत की परिणामी निरंतरता उच्च प्रत्यक्षता दरों के साथ कम thrombogenic घावों में परिणाम है, और अंत में, उच्च सफलता दर ।
इस मॉडल में, धमनी सम्मिलन दाता भ्रष्टाचार के उदर महाधमनी खींच द्वारा प्राप्त की है umbilicus आम मन्या प्राप्तकर्ता जानवर की धमनी पर । भ्रष्टाचार के शिरापरक जल निकासी प्राप्तकर्ता के umbilicus बाहरी jugular नस पर भ्रष्टाचार के पोर्टल नस खींच द्वारा हासिल की है । इस पांडुलिपि विवरण और अंग वसूली और अंग प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं है, जो microsurgical कौशल के साथ शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगशालाओं में सफलतापूर्वक प्रत्यारोपण करने के लिए अनुमति देगा के महत्वपूर्ण कदम प्रदान करता है ।
Introduction
एक साथ गुर्दा-अग्ंयाशय प्रत्यारोपण (SPK) मधुमेह और अंत चरण गुर्दे की बीमारी से पीड़ित रोगियों के लिए देखभाल के मौजूदा मानक का प्रतिनिधित्व करता है । दीर्घकालिक इंसुलिन स्वतंत्रता स्थिरीकरण या मधुमेह microangiopathy के भी प्रतिगमन और जीवन की एक बेहतर गुणवत्ता के साथ जुड़े में सफल प्रत्यारोपण परिणाम1. हालांकि, अंय आम ठोस अंग प्रत्यारोपण के विपरीत, गुर्दे और जिगर प्रत्यारोपण की तरह, अग्नाशय भ्रष्टाचार और अधिक ischemia reperfusion चोट (इरि) के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । ३५% तक की घटनाओं की सूचना केवल भ्रष्टाचार नहीं ख़तरे में डालना, लेकिन यहां तक कि रोगी, अस्तित्व2,3।
Oxidative तनाव, microvasculature विकारों, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस की वृद्धि की अभिव्यक्ति, और आसंजन endothelial सक्रियण और अपनी अखंडता के नुकसान में अंत में जिसके परिणामस्वरूप अणुओं, सभी इस गैर allogeneic भ्रष्टाचार को चोट के लिए जिंमेदार ठहराया गया है 4. अब तक, इरि के सटीक आणविक तंत्र मोटे तौर पर अनजान होते हैं और अंग-अंग से भिन्न हो सकते हैं ।
प्रमुख विट्रो में मॉडल का उपयोग प्रगति के बावजूद, पशु मॉडलों के विकास के लिए आणविक इरि में शामिल तंत्र का ज्ञान गहरा करने के लिए महत्वपूर्ण है, अग्न्याशय प्रत्यारोपण के बाद भ्रष्टाचार में परिवर्तन जुड़े. कई अग्ंयाशय प्रत्यारोपण मॉडल कुतर5,6में विकसित किया गया है, लेकिन केवल एक चूहों7में रिपोर्ट की है । इस अत्यधिक मांग microsurgical प्रक्रिया की दुखती एड़ी ४६% की कम जीवित रहने की दर है । हालांकि, माउस मॉडल प्रत्यारोपण से संबंधित अनुसंधान के लिए सबसे अच्छा मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, आणविक विश्लेषण उपकरणों की व्यापक विविधता के बाद से उन पर लागू किया जा सकता है । विभिन्न अंग प्रत्यारोपण के साथ चूहों में व्यापक microsurgical अनुभव के आधार पर8,9,10, हम heterotopic, गर्भाशय ग्रीवा अग्ंयाशय के लिए एक नया, अत्यधिक प्रतिलिपि तकनीक विकसित & #62 के साथ चूहों में रोपाई; ९०% सफलता दर एक गैर सीवन कफ तकनीक का उपयोग कर । इस तकनीक के साथ, anastomoses से संबंधित जटिलताओं को कम कर रहे हैं, और एक उच्च सफलता दर की तुलना में प्राप्त किया जा सकता है सीवन मॉडल11। अब तक इसी तरह की सफलता दरों के साथ केवल एक माउस मॉडल लियू एट अल12द्वारा वर्णित किया गया है । हालांकि, अब तक इस मॉडल का उपयोग कर प्रकाशित अध्ययन नहीं कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इरि-जुड़े भ्रष्टाचार नुकसान ठोस अंग प्रत्यारोपण करने के लिए अंतर्निहित है, और यह microcirculation की एक अशांति की विशेषता है । कोरोनरी चरण के दौरान कई चयापचयों के संचय, और भड़काऊ मुख्य रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों द्वारा मध्यस्थता की दीक्षा, भ्रष्टाचार के दौरान ऊतक क्षति में परिणाम reperfusion4. यह झरना न केवल अल्पकालिक, लेकिन यह भी दीर्घकालिक सफलता ख़तरे में डालना हो सकता है और, इसलिए, काफी प्रभावित रोगियों को जीवित रहने के14। तिथि करने के लिए, संयुक्त गुर्दा अग्ंयाशय ट्रांसप्लांटेशन प्रकार से पीड़ित रोगियों के लिए पसंद की चिकित्सा का प्रतिनिधित्व करता है 1 अंत चरण गुर्दे की बीमारी के साथ मधुमेह15. कई अध्ययनों से पता चला है कि एक सफल संयुक्त गुर्दे अग्ंयाशय प्रत्यारोपण ही बहाल नहीं करता है और मधुमेह प्राप्तकर्ताओं में गुर्दे भ्रष्टाचार समारोह की रक्षा, लेकिन यह भी स्थिर या भी न्यूरोपैथी सहित माध्यमिक जटिलताओं, उलट सूक्ष्म और macroangiopathy16,17,18।
कमी, प्रतिस्थापन में निरंतर प्रयासों के बावजूद, और शोधन (3 R ‘ s) पशु अनुसंधान में, इरि तरह जटिल pathophysiological प्रक्रियाओं के प्रजनन में केवल असंभव है इन विट्रो सेटिंग्स । इसलिए, पशु मॉडल अभी भी शोधों अनुसंधान19,20के लिए आदर्श उपकरण माना जाता है । यहां वर्णित एक तरह माउस मॉडल चूहे या अंय जानवरों के मॉडल की तुलना में कई फायदे हैं । ये आनुवंशिक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित नस्ल माउस उपभेदों की एक विशाल मात्रा की उपलब्धता शामिलहै (जैसे ट्रांसजेनिक और दस्तक बाहर उपभेदों), आणविक विश्लेषण उपकरण के ढेर सारे, साथ ही साथ एक आसान और सस्ते हैंडलिंग21। वर्णित मॉडल का एक प्रमुख लाभ गैर-सीवन कफ तकनीक में निहित है । इस स्पेसिफिकेशंस प्रस्तुत तकनीक का उपयोग करते हुए & #62 की सफलता दर; ९०% प्राप्त कर रहे हैं, जो नाटकीय रूप से पहले वर्णित मॉडल की तुलना में बेहतर है22. इस गैर टांका तकनीक का उपयोग करना, हम काफी hypovolemic सदमा, घनास्त्रता, और anastomoses का एक प्रकार का रोग की तरह आम जटिलताओं को कम12। इस विधि का एक और लाभ भ्रष्टाचार के अतिरिक्त पेट की स्थिति के होते हैं, जो प्राप्तकर्ता के तेजी से पश्चात वसूली के साथ जुड़ा हुआ है । इसके अतिरिक्त, गर्भाशय ग्रीवा के स्थान के लिए यह पूरी तरह से उपयुक्त vivo में विश्लेषण करती है, जैसे किसी भी तनाव के बिना बाहरी द्वारा भ्रष्टाचार के लाइव इमेजिंग22।
इस मॉडल के मुख्य दोष अग्नाशय वाहिनी, जो नैदानिक वास्तविकता के समान नहीं है की रोड़ा है । इस मॉडल में, रिसाव ड्रेनेज choledocho-अग्नाशय वाहिनी बांधने के द्वारा प्रबंधित किया जाता है । लंबे समय में, एक चिह्नित फाइब्रोसिस और भ्रष्टाचार के लिए प्रमुख अग्नाशयशोथ22के बिना ग्रंथि के शोष में यह परिणाम है । रिसाव ऊतक, जो हम प्रत्यारोपण के बाद 30 दिन के रूप में जल्दी के रूप में मनाया के इस गिरावट के कारण, हम मानते है कि इस मॉडल के दीर्घकालिक प्रेक्षण के लिए अनुकूल नहीं है । इसके विपरीत, अछूता अंत में स्रावी समारोह प्राप्तकर्ता के gylcemic नियंत्रण भ्रष्टाचार13,23,24के समारोह के दैनिक आकलन के लिए एक आसान उपकरण बनाता है ।
इन विशेषताओं जल्दी भ्रष्टाचार लंबे समय से संरक्षण अवधि के साथ जुड़े चोटों या अलग संरक्षण समाधान और तकनीकों के साथ विश्लेषण के लिए यह एक आदर्श मॉडल बनाता है । इस मॉडल के साथ इष्टतम सफलता प्राप्त करने के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम पर विचार किया जाना चाहिए । अग्ंयाशय ही बहुत हेरफेर करने के लिए अतिसंवेदनशील है । इसलिए, कोमल हैंडलिंग कपास का उपयोग अंग वसूली के दौरान चिपक जाती है और प्रत्यारोपण के दौरान यांत्रिक आघात को कम करता है । संदंश के साथ ग्रंथि के प्रत्यक्ष लोभी बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह अनिवार्य रूप से गंभीर भ्रष्टाचार के नुकसान में परिणाम होगा । एक ही कारण के लिए, तिल्ली अग्ंयाशय के साथ एक साथ बरामद किया गया है, और एक संभाल के रूप में इस्तेमाल होता है । यह भी नैदानिक अभ्यास में स्थापित है । एक और ख़तरा शीत छिड़काव शामिल है, जो छिड़काव द्वारा महाधमनी स्टंप के माध्यम से हासिल की है 4 ° c histidine-tryptophan-ketoglutarate छिड़काव समाधान का उपयोग करके । इसके द्वारा, ग्रंथि के एक अत्यधिक सूजन धीरे भ्रष्टाचार perfusing से बचा जा सकता है । शेष छिड़काव समाधान भ्रष्टाचार को गीला करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, ताकि अंग वसूली के दौरान अपने तापमान कम रखने के लिए ।
प्राप्तकर्ता तैयारी के संबंध में दोनों बाहरी jugular नस के एक सावधान विच्छेदन के साथ ही आम मन्या धमनी सफल revascularisation के लिए आधार सेट. विशेष रूप से, न केवल सभी सहायक को हटाने से नस की पूरी जोखिम, लेकिन यह भी आसपास के वसा ऊतक, क्रम में आवश्यक है बाहरी संपीड़न और शेष वसा ऊतक द्वारा एक प्रकार का रोग से बचने के लिए । उपयुक्त कफ व्यास का चयन महत्वपूर्ण है । साझा अनुभव के आधार पर, 25 से 28 जी के बीच वजन चूहों के लिए, धमनी कफ के लिए ०.५७ मिमी के एक भीतरी व्यास, और के बीच ०.७५ और ०.८ mm शिरापरक कफ के लिए, उपयुक्त है । कफ के किनारों की सटीक, साफ कटिंग पोत स्टंप फाड़ने से बचना अनिवार्य है । जहाजों के फैलाव, विशेष रूप से धमनी की, ठीक सुझावों के साथ पोत dilatators का उपयोग करके सबसे अच्छा हासिल किया है । अंगूठे के एक नियम के रूप में, पोत को दो बार कफ के लुमेन को चौड़ा करने में सक्षम होना चाहिए । पर पोत everting और यह कफ पर फिक्सिंग की प्रक्रिया के दौरान, हम उंहें एक त्वचा प्रालंब के तहत रखकर संवहनी clamps की सिफारिश, के रूप में यह इस महत्वपूर्ण कदम आसान बनाता है ।
के रूप में पहले से ही उल्लेख किया, गैर सीवन कफ-तकनीक संवहनी सम्मिलन के लिए एक आसान तरीका का प्रतिनिधित्व करता है और 5 मिनट के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है । हालांकि, प्राप्तकर्ता की गर्दन क्षेत्र में भ्रष्टाचार की सही स्थिति सही revascularization के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है । इसके द्वारा, गर्दन के क्षेत्र में भ्रष्टाचार के अंतिम सही स्थिति के लिए एक सुरक्षित, सीधे, और दोनों नस और धमनी के तनाव से मुक्त सम्मिलन की अनुमति के लिए प्रत्याशित हो गया है । जहाजों कि बहुत लंबे समय से बचा जा करने के लिए है, क्योंकि यह गुत्थी के कारण रुकावट बहिर्वाह के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसी कारण से, शिरापरक सम्मिलन पर कफ को संभालने के बाद reperfusion भी हटाया जाना चाहिए । अग्नाशय भ्रष्टाचार से स्थानीयकृत रक्तस्राव के मामलों में, सफल रक्तस्तम्भन धीरे कपास छड़ें का उपयोग कर 5 मिनट के लिए खून बह रहा पक्ष compressing द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इस तरह की जटिलता का प्रबंधन करने के लिए यह एकमात्र सफल तरीका है ।दाग़ना, भले ही उच्च चयनात्मक, लगभग सभी मामलों में भ्रष्टाचार के नुकसान के परिणामस्वरूप, गल अग्नाशयशोथ के कारण ।
सारांश में, हम एक गैर सीवन कफ तकनीक है, जो तकनीकी और microsurgically संभव है और उत्कृष्ट सफलता दरों का उपयोग कर चूहों में अग्ंयाशय ट्रांसप्लांटेशन के लिए एक विधि विकसित की है । डक्ट रोड़ा के कारण अग्ंयाशय के progredient फाइब्रोसिस को देखते हुए, इस मॉडल को जल्दी भ्रष्टाचार के नुकसान पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान क्षेत्रों के लिए सबसे उपयुक्त है । यह पांडुलिपि शोधकर्ताओं को सुरक्षित रूप से अपनी प्रयोगशालाओं में इस मॉडल को स्थापित करने की अनुमति देने का इरादा है ।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अनुदान #2008-1-596 और #UNI-0404/1956 के “Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)” (https://www.tirol.gv.at/en/) द्वारा समर्थित किया गया था, और चिकित्सा विश्वविद्यालय Förderungsprogramm के “MUI-Start Innsbruck” के अनुदान #2013-०४२०१८ द्वारा ।
Materials
| Adventitia Scissors | S&T | S-00102 | Straight |
| Dumont # 7 Forceps | FST | 11271- 30 | Curved Tip 0.17 x 0.1 mm |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S&T | B1 00396 V | |
| Vessel dilatator | S&T | D-5a.2, 00125 | |
| Clip applier | S & T | CAF-4 00072 | for venous cuff |
| Clip applier | Aesculap | FE572K | for the arterial cuff |
| Polyethylene tube | Portex Ltd | Inner diameter 0.75 mm for venous cuff | |
| Polymide tubing | Vention Medical | 141-0051 | Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd) |
| Polymide tubing | Vention Medical | 141-0033 | Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff |
| Bipolar forceps | Micromed | 140-100-015 | |
| 8/0 silk ligatures | Catgut GmbH, Merkuramed | 17209008 | |
| Custodiol HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie | 59997 | |
| Ketamin Graeub | aniMedica GmbH | 32554 | |
| Xylasol Graeub | aniMedica GmbH | 50855 |
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