Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Summary

Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.

Abstract

Nossos estudos de laboratório humano doenças mieloproliferativas induzidas por oncogenes, como Bcr-Abl ou receptor do fator de crescimento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Somos capazes de modelo e estudo de doenças humanas-como em nosso modelo de mouse, através do transplante de células da medula óssea previamente infectadas com um retrovírus expressando o oncogene de interesse. Replicação defeituosa retrovírus codificação de um oncogene humano e um marcador (GFP, RFP, o gene de resistência a antibióticos, etc) é produzido por um protocolo de transfecção transiente usando células 293T, uma linha celular humana renal epiteliais transformadas pelo produto do gene E1A do adenovírus. 293 células têm a propriedade incomum de ser altamente transfectable por fosfato de cálcio (CAPO _4), com até 50-80% de eficiência de transfecção prontamente atingível. Aqui, nós co-transfecção 293 células com um vetor retroviral expressando o oncogene de interesse e um plasmídeo que expressa as funções gag-pol-env embalagens, tais como o genoma de um único embalagem constrói kat ou PCL, neste caso, o Ecopak plasmídeo. A transfecção inicial é melhorada pelo uso da cloroquina. Estoques de vírus ecotropic, coletados como cultura sobrenadante de 48 horas. pós-transfecção, podem ser armazenadas a -80 ° C e utilizado para a infecção de células-lines em vista da transformação e estudos in vitro, ou pilhas como as células da medula óssea do rato, que pode então ser utilizada para transplante em nosso modelo de camundongo .

Protocol

A noite antes que as células de transformação, placa 293T em 3-5×10 6 células / 6 cultureplate tecido cm. Nota: Nós usamos células 293T pela sua facilidade de transfecção e células produtoras de vírus efficacyas. Estas células são deficientes em embalagens do vírus, a menos que um ajudante plasmídeo é introduzido. A primeira manhã, remova médio e substituir com 4 ml de células 293T med contendo 25 mM cloroquina. Coloque em uma incubadora para hr. <e…

Discussion

Quatro pontos críticos vai garantir o sucesso de um bom estoque viral:

1. As células 293T produzir têm de ser muito saudável, o que significa que foram divididas em uma programação muito regular, nunca foram cobertas, e são banhados na densidade otimizada de 3,5-5.000.000 por 6 centímetros placa de cultura de tecido, para que atinjam uma densidade de 80% da placa, na manhã da transfecção.
   
2. Além da cloroquina melhora a eficiência de transfecção e titulação do vírus subseqüentes, cerca de 3 – …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
293T cells	cell-line			Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well.
293T cell medium				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro.
coding DNA plasmid				Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.)
EcoPak				also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env
2x HBS				For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight.
2M CaCl2		Sigma
miliQ H2O				sterile-filtered
Chloroquine				1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed.
6 cm plates				for tissue culture
Incubator				for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2.
10 cc sterile syringes				Sterile. One per virus type.
18G needles				single use, one per virus type.
45 um syringe filters
5 ml plastic tubes				Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes.
50 ml conical tubes
cryovials				2 and 4 ml, for virus aliquots.

All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl₂, 2x HBS, miliQ H₂O) and kept sterile.