JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Drosophila Utarbeidelse og Longitudinal Imaging av hjertefunksjonen in vivo ved hjelp Optical Coherence Mikroskopi (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Langsgående studium av hjertet i små dyr bidrar til å forstå en rekke humane relaterte kardiovaskulære sykdommer, slik som genet knyttet medfødt hjertefeil 1,2. I de siste tiårene, ulike dyremodeller, for eksempel mus 3,4, Xenopus 5,6, sebrafisk 7,8, avian 9, og Drosophila 10-16, har blitt brukt til å gjennomføre det menneskelige hjerte-utvikling relatert forskning. Musen Modellen har vært mye brukt til å studere normale og unormale hjerte utvikling og hjerte defekt fenotyper grunn av sine likheter med det menneskelige hjertet 3,4. Xenopus embryo er spesielt nyttig i studiet av hjerte utvikling på grunn av enkel håndtering og delvis gjennomsiktighet 5,6. Gjennomsiktigheten av embryoet og tidlig larve av sebrafisk-modellen gir enkel optisk observasjon av hjerte utvikling 7,8. Avian modellen er et felles tema for utviklingshjerte studier because hjertet kan være lett tilgjengelig etter fjerning av eggeskall og den morfologiske likheten av aviær hjerter for mennesker 9. Den Drosophila modellen har noen unike funksjoner som gjør den ideell for å utføre longitudinelle studier av hjertet. Først, i hjertet rør av Drosophila er ~ 200 mikrometer under den dorsale overflate, som gir enklere for optisk tilgang og overvåkning av hjertet. I tillegg er mange molekylære mekanismer og genetiske trasé konservert mellom Drosophila og virveldyr. De ortologer på over 75% av menneskelige sykdomsgener ble funnet i Drosophila, som har gjort det mye brukt i transgene studier 11,13. Videre har den en kort livssyklus og lave vedlikeholdskostnader, og har blitt brukt som et eksemplar modell for utviklingsbiologi forskning 14-16.

Tidligere rapporter beskrev protokoller for overvåking av Drosophila hjertefunksjoner slik som hanArtbeat. Men disseksjon prosedyrer var nødvendig 17,18. Optisk imaging gir en effektiv måte for å visualisere hjerte utvikling hos dyr på grunn av sin ikke-invasive karakter. Ulike optiske bildediagnostikk har blitt brukt til å utføre dyr hjertestudie, for eksempel to-foton mikroskopi 19, konfokalmikroskopi 20,21, lys ark mikroskopi 22, og optisk koherens tomografi (OCT) 16,23-26. Relativt, er oktober i stand til å gi god bildedybde i små dyrehjerter uten bruk av kontrastmidler, samtidig som en høy oppløsning og en ultrahøy bildehastighet, noe som er viktig for bildebehandling levende dyr. I tillegg har den lave kostnaden for å utvikle en oktober system popularisert denne teknikken for optisk avbildning av prøver. Oktober har blitt brukt for den langsgående studium av Drosophila. Bruk av oktober, hjerte morfologisk og funksjonell avbildning har blitt utført for å studere hjerte strukturer, den funcelle roller gener og mekanismer for kardiovaskulære defekter i mutant modeller under hjerte utvikling. For eksempel ble aldersavhengig hjertefunksjon nedgang bekreftet med nedregulert angiotensin-converting enzyme relaterte (ACER) genet i Drosophila med 27 oktober. Fenotyping av genet relatert kardiomyopati ble vist i Drosophila hjelp oktober 28-33. Forskning ved hjelp oktober avslørte også den funksjonelle rollen til det humane genet SOX5 i sentrum av Drosophila 34. Sammenlignet med oktober, bruker OCM et mål med en høyere numerisk apertur for å gi bedre tverrgående oppløsning. I det siste, har hjertet dysfunksjon forårsaket av stanse en ortolog menneskelige biologiske genet dCry / dClock blitt undersøkt ved hjelp av en tilpasset OCM system 15,16, samt effekten av høy-fett-diett på cardiomyopathies i Drosophila å forstå fedme indusert menneskelig hjertesykdommer. 15

Her the eksperimentelle protokollen er oppsummert for longitudinell studie av hjerte morfologiske og funksjonelle endringer i Drosophila på andre stadium (L2), tredje stadium (L3), puppe dag 1 (PD1), puppe dag 2 (PD2), puppe dag 3 (PD3) , puppe dag 4 (PD4), puppe dag 5 (PD5), og voksne (figur 1) ved hjelp OCM å legge til rette studiet av menneskelige relaterte medfødte hjertefeil. Hjerte funksjonelle parametre, som HR og CAP ble analysert kvantitativt på ulike utviklingsstadier for å avdekke hjerte utviklingstrekk.

Protocol

1. Utarbeidelse av OCM System for optisk avbildning av Drosophila 16

  1. Velg et spektrometer og en høyhastighets linje skanning kamera som gir en bildefrekvens på minst 80 ramme / sek så OCM systemet vil være i stand til å løse hjerterytme av Drosophila.
  2. Bruke en bredbånds lyskilde for å sikre den aksielle oppløsning på 2 um for å identifisere hjertet strukturen i Drosophila.
  3. Bruk en 10X mål å oppnå en høy tverr oppløsning.
  4. Bruke…

Representative Results

Den langsgående hjerteavbildning ble utført ved hjelp av bananfluer med 24B-GAL4 / + belastning ved romtemperatur med OCM. Målinger ble utført ved L2, L3, og ved 8 timers intervaller fra PD1 til PD4, og voksen dag 1 (AD1) for å spore metamorfose fremgangsmåte (tabell 1). Larva, tidlig puppe sent Pupa og voksne fluer ble montert på glassplater som vist i figur 1A. Segment funksjonene i hjertet for larver og voksne fluene ble vist i de skjematiske fremstillinger i figur 1B….

Discussion

Den raske hjerteslag Drosophila, med en maksimal HR rundt 400 bpm på larve og voksne stadier, krever høy bildehastighet for å løse hjerte diastoles og systoler (ikke mindre enn 80 bilder / sek basert på erfaringer). På grunn av den lille størrelse hjertekammeret og mikron skala hjerteveggtykkelse (5 – 10 um), en høy romlig oppløsning (bedre enn 2 um) er nødvendig for å løse de hjerte rør strukturer. I denne studien ble en høy oppløsning og ultrahøy hastighet OCM system som er utviklet, hvor et s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Tags

Keywords: DrosophilaHeart FunctionOptical Coherence Microscopy (OCM)Cardiac DevelopmentLongitudinal ImagingIn VivoMetamorphosisGenetic SimilaritiesVertebratesOptogenetic PacingPacemaker FunctionLarva MountingDevelopmental StageHeart TubeA-scansB-scansScanner VoltageTransverse Direction
check_url/55002?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image