This protocol outlines a comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow for novice bioinformaticians. The workflow is available for free entirely through CyVerse and connected by the Data Store. Command line and graphical user interfaces are used, but all code needed is available to copy and paste.
Denne arbejdsgang gør det muligt for nybegyndere at udnytte avancerede beregningsmæssige ressourcer som cloud computing til at udføre parvis sammenlignende transcriptomics. Det tjener også som en primer for biologer til at udvikle datavidenskabers beregningsmæssige færdigheder, fx udførelse af bash-kommandoer, visualisering og styring af store datasæt. Alle kommandolinjekoder og yderligere forklaringer af hver kommando eller trin kan findes på wiki ( https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ ). Discovery Environment og Atmosphere platforme er forbundet sammen gennem CyVerse Data Store. Som sådan, når først de oprindelige rå sekventeringsdata er blevet uploadet, er der ikke længere behov for at overføre store datafiler over en internetforbindelse, hvilket minimerer mængden af tid, der er nødvendig for at foretage analyser. Denne protokol er designet til kun at analysere to eksperimentelle behandlinger eller betingelser. Differentiel genekspression analyse udføres thrDybe parvise sammenligninger, og vil ikke være egnet til at teste flere faktorer. Denne arbejdsgang er også designet til at være manuel snarere end automatiseret. Hvert trin skal udføres og undersøges af brugeren, hvilket giver en bedre forståelse af data og analytiske output og dermed bedre resultater for brugeren. Når denne protokol er afsluttet, giver denne protokol de novo- samlede transkriptomer til underordnede organismer uden organisering uden at skulle kortlægge til tidligere sammensatte referencemønstre (som normalt ikke er tilgængelige i underbevarede organismer). Disse de novo transkriptomer anvendes yderligere i parvis differentiel genekspression analyse for at undersøge gener, som adskiller sig fra to forsøgsbetingelser. Differentielt udtrykte gener bliver derefter funktionelt annoteret for at forstå, at de genetiske reaktionsorganismer har forsøgsbetingelser. I alt anvendes dataene fra denne protokol til at teste hypoteser om biologiske reaktioner hos underbevarede organismer.
Homo sapiens og flere hovedmodel dyrearter som Drosophila melanogaster , Mus musculus og Danio rerio repræsenterer størstedelen af nuværende og tidligere funktionelle genomics arbejde. Den hastigt faldende pris for high-throughput-sekventeringsteknologi giver imidlertid muligheder for funktionel genomik i ikke-model ( aka "neglected" eller "underserved") dyreart 1 . Dette er en vigtig overgang i genomik, idet ikke-modelorganismer ofte repræsenterer økonomisk relevante arter ( fx østers, rejer, krabber) og giver mulighed for at undersøge nye fænotyper og biologiske systemer uden for rammerne af dem, der findes i modelarter.
Selvom underbevarede organismer udgør en attraktiv mulighed for at undersøge unikke biologiske systemer, står de forskellige udfordringer over for forskere, især under bioinformatisk analyse. Nogle afSe udfordringer er medvirkende til at behandle store datasæt, mens andre er resultatet af manglen på genetiske ressourcer til rådighed for forskere, der arbejder i underordnede organismer, såsom et referencegenom, organisme-specifikke ontologier osv . Udfordringerne med nukleinsyreisolering og sekventering er ofte rutinemæssige i Sammenligning med dataanalysen, og som sådan viser bioinformatiske analyser generelt den mest undervurderede pris for sekventeringsprojekter 2 . For eksempel kan en grundlæggende næste generations sekventerende bioinformatisk analyse bestå af følgende trin: kvalitetsfiltrering og trimning af rå sekventering læser, samling af korte læses i større sammenhængende stykker og annotering og / eller sammenligninger med andre systemer for at opnå biologisk forståelse. Selvom det er tilsyneladende simpelt, kræver dette arbejdsproces i specialkundskaber og beregningsmæssige ressourcer ud over en labbænkcomputer, hvilket gør det utilgængeligt for mange forskere at studere ikke-Modelorganismer.
Indige udfordringer kan være infrastruktur- eller vidensbaserede. En klassisk infrastrukturudfordring er adgang til passende beregningsmæssige ressourcer. For eksempel er samling og annotation afhængig af computationally-intensiv algoritmer, der kræver kraftige computere eller computerklynger, der har stor mængde RAM (256 GB-1 TB) og flere processorer / kerner til at køre. Desværre har mange forskere heller ikke adgang til sådanne databehandlingsressourcer eller har ikke den viden, der er nødvendig for at interagere med disse systemer. Andre forskere kan få adgang til højtydende computerklynger gennem deres universiteter eller institutioner, men adgangen til disse ressourcer kan være begrænset og nogle gange resulterer i gebyrer pr. Beregningstid, dvs. antallet af CPU-processorer multipliceret med antallet af realtidsklokke Timer "at disse processorer kører. Udnyttelse af et cyberinfrastruktur system finansieret af US National Science Foundation sUanset som CyVerse 3, der giver fri adgang til beregningsressourcer for forskere, i USA og rundt om i verden, kan bidrage til at lette infrastrukturudfordringer, som det vil blive demonstreret her.
Et eksempel på en typisk videnbaseret udfordring er at forstå den software, der er nødvendig til komplette analyser. For effektivt at gennemføre et sekventeringsbaseret projekt skal forskere være bekendt med de utallige softwareværktøjer, der er udviklet til bioinformatiske analyser. At lære hver pakke er vanskelig i sig selv, men forværres af, at pakker løbende opgraderes, genudleveres, samles i nye arbejdsgange, og nogle gange bliver begrænset til brug under nye licenser. Derudover kræver sammenkædning af input og output af disse værktøjer undertiden omdannelse af datatyper til at gøre dem kompatible og tilføjer et andet værktøj til arbejdsgangen. Endelig er det også svært at vide, hvilken softwarepakke der erE best "til en analyse, og ofte identificering af den bedste software til særlige eksperimentelle forhold er et spørgsmål om subtile forskelle. I nogle tilfælde er nyttige anmeldelser af software tilgængelige, men på grund af den fortsatte udgivelse af nye opdateringer og softwaremuligheder er disse hurtigt gået forældet.
For forskere, der undersøger underordnede organismer, kommer disse medfødte udfordringer ud over de udfordringer, der er forbundet med at analysere data i en ny organisme. Disse underordnede organisme-specifikke udfordringer illustreres bedst under genannotering. For eksempel har underbevare organismer ofte ikke en nært beslægtet modelorganisme, der med rimelighed kan bruges til at identificere gen-ortologi og funktion ( fx marine hvirvelløse dyr og Drosophila ). Mange bioinformatiske værktøjer kræver også "træning" for at identificere strukturelle motiver, som kan bruges til at identificere genfunktionen. Men træningsdata er normalt kun tilgængelige for modEl-organismer og træning af skjulte Markov-modeller (HMM'er) ligger uden for biologernes område og endda mange bioinformatikere. Endelig kan selvom annoteringer udføres ved hjælp af data fra modelorganismer nogle gengenologier forbundet med modelorganismer ikke fornuftigt, når biologien og naturhistorien hos den underbeviste organisme overvejes ( fx overførsel af information fra Drosophila til rejer).
I lyset af disse udfordringer skal bioinformatiske ressourcer udvikles med forskere, der udfører de novo- analyser på underordnede organismer specifikt i tankerne. De næste mange års funktionelle genomiske sekventeringsprojekter vil bidrage til at lukke kløften mellem model og underserverede organismer ( https://genome10k.soe.ucsc.edu/ ), men der er mange værktøjer , der skal udvikles for at løse udfordringerne Overvejet ovenfor. CyVerse er dedikeret til at skabe økosystemer af iNteroperability ved at forbinde eksisterende cyberinfrastruktur og tredjeparts applikationer til at levere datastyring, bioinformatiske analyseværktøjer og datavisualiseringer til livforskere. Interoperabilitet hjælper med at lette overgangen mellem bioinformatiske applikationer og platforme ved at levere skalerbare databehandlingsressourcer og begrænse konverteringer af filformat og mængden af data, der overføres mellem platforme. CyVerse tilbyder flere platforme, herunder Discovery Environment (DE 4 , Atmosphere 5 og Data Store 3. DE er webbaseret og har mange fælles bioinformatik analyseværktøjer konverteret til brugervenlige point-and-click-formater (kaldet "apps "), Og er den grafiske brugergrænseflade (GUI) til datalageret, hvor store datasæt ( dvs. rå sekventering læses, samles genomer) gemmes og styres. Atmosfære er en cloud computing service, der giver forskere øget fleksibilitet tilVed hjælp af Virtual Machine beregningsmæssige ressourcer, som har en bred vifte af bioinformatik værktøjer forudinstalleret. Begge disse platforme er knyttet til datalageret og kan bruges sammen til at skabe arbejdsgange som det her beskrevne. Denne rapport fokuserer på en de novo transkriptom samling og differentierede genekspression analyser arbejdsgange, og yderligere adresserer nogle bedste praksis i forbindelse med udvikling og gennemførelse af bioinformatiske analyser. En forklaring på CyVerse's bredere mission ( http://www.cyverse.org/about ) og detaljerede platformbeskrivelser ( http://www.cyverse.org/learning-center ) er offentligt tilgængelige. Alle analyser, der beskrives her, anvender Discovery Environment 4 (DE) og Atmosphere 5 og er præsenteret på en måde, der gør dem tilgængelige for forskere af alle beregningsniveauer. DE-arbejdsgange og AtmosphEre billeder kan henvises direkte ved hjælp af webadresser for at sikre langsigtet herkomst, genbrugelighed og reproducerbarhed.
Der er fem kritiske trin i protokollen, der hver især opretter deres egen separate mappe inde i hovedprojektmappen ( figur 1 og 2 ). Alle de primære rå-sekventeringsdata er uskadelige: den skal uploades og opbevares i den første mappe mærket "1_Raw_Sequence" og ændres ikke på nogen måde. Data kan uploades på en af tre måder. DE-grænsefladen kan bruges til at uploade filer direkte. Dette er den nemmeste måde at uploade data på, men det vil også tage længst tid at overføre. Cyberduck har en grafisk grænseflade og giver brugerne mulighed for at trække og slippe filer for at overføre til DE. ICommands er et kommandolinjeværktøj, som kan bruges til at overføre data til og fra datalageret, lave mapper og administrere datasæt, og det er sandsynligvis den hurtigste måde at overføre datafiler på. Alle data i datalageret kan deles med andre brugere af CyVerse (https://wiki.cyverse.org/wiki/display/DEmanual/Sharing+Data+Files+and+Folders+Via+the+DiscoveRy + miljø), offentliggjort via en genereret webadresse (https://wiki.cyverse.org/wiki/display/DEmanual/Sharing+Data+Files+Via+Public+Links), eller kan være vært for offentligt og anonymt ( Ingen brugernavn påkrævet) tilgængelige fællesskabsdata (http://data.iplantcollaborative.org; http://mirrors.cyverse.org). Inde i denne mappe analyseres de rå sekvenser med FastQC (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) for at vurdere, hvordan man trimmer og filtrerer læsningerne for at generere højkvalitetslæsninger. Efter trimning og kvalitetsfiltrering er det nyttigt at sammenligne FastQC-udgangene for at bestemme, om læsekvaliteten er ændret for at bestemme, at den er blevet bedre uden at miste information ( figur 3 ). Bemærk at xQ-aksen i FastQC ikke er lineær, men snarere er indad for mange outputgrafer, hvilket kan føre til fejlfortolkning af resultater. De trimmede og filtrerede læsninger bruges derefter til at samle de novo transkriptomer ved hjælp af en atmosfære cloud computing instans. Det herSky computer bruger den lokale computerskærm, tastatur og mus, men har sin egen software (Trinity og Trinotate) og hardware installeret. Løbende programmer på cloudcomputer-forekomsten påvirker ikke den lokale computer på nogen måde. De novo samling og downstream annotation vil sandsynligvis være de to længste trin i denne workflow. Derfor afsluttes de på atmosfæren for at undgå almindelige lab-delte computerproblemer, der ville afbryde analysen som strømbrud, genstarte efter automatiske opdateringer i efterladte eller i tilfælde af sammenbrud forårsaget af andre brugere. Trinotat-annotation anvender BLAST + 8 , HMMER 9 , tmHMM 10 og PFAM 11 . Den endelige udgave af annotationen er en SQLite database og en .xls fil. Udgangene kan bruges udenfor CyVerse i downstream analyse platforme som KEGG 12 , 13 .
Denne arbejdsgangEr klar til brug i DE og Atmosphere. Dette eliminerer behovet for at bruge tid på at installere, konfigurere og fejlfinding hver analysepakke og alle afhængigheder, som hvert værktøj kræver. Dette strømlinjeformer forskernes analyser, minimerer spildt indsats og sænker adgangsbarrieren for mange forskere. Denne workflow samler specifikt enten single- eller paired-end fra Illumina-sekventeringsplatformen, men mange værktøjer findes i DE og Atmosphere til at håndtere andre former for sekventeringsteknologier. Værktøjer i denne workflow kan nemt erstattes med et tilsvarende alternativt værktøj til at håndtere enhver form for indgående sekventeringsteknologi. Dette gælder også for nye versioner af analyseværktøjer eller helt nye værktøjer.
Denne arbejdsgang er specielt designet til at samle, sammenligne og annotere kun nogle få transkriptomer ad gangen. Derfor kan brugerne finde tidskrævende at samle flere transkriptomer til komparativ population genetik. AnalyseRørledninger vil være tilgængelige for befolkningen genetik brugere i den nærmeste fremtid og linket til rørledningen kan findes på wiki siden (https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ). Differentielle genekspression analyse trin kan håndtere replikater, men det er en parvis sammenligning og vil ikke nøjagtigt vurdere flere faktorer ( fx betingelser, der varierer over tid, mere end to behandlinger). Automatiske arbejdsgange eksisterer for organismer med referencegener ( fx TRAPLINE 14 ). Selvom automatiserede arbejdsgange er det nemmeste at bruge til nybegyndere, kræver de novo forsamlinger vurdering og overvejelse for hvert trin, der er skitseret her. Derudover er brugerne forpligtet til at anvende automatiserede rørledninger, som de er konstrueret, og er derfor iboende ikke fleksible til at imødekomme brugerens skiftende krav.
Da den meste af denne protokol udføres via internettet, kan brugerne opleve problemer med deres browserindstillinger. For det første,Popup-blokkere kan holde vinduerne åbent overhovedet, eller kan holde vinduerne åbent, indtil CyVerse er tilladt i browseren. Atmosfære bruger VNC til at få adgang til fjernbetjeninger, men anden software kan bruges. Hele denne protokol blev udført i Firefox version 45.0.2 og skal fungere sammen med alle populære internetbrowsere, men nogle inkonsekvenser kan forekomme. Arbejdsstrømmen opdateres, da Trinity udgiver nye versioner (https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki). De nyeste versioner og opdaterede oplysninger om workflow findes på wiki-vejledningssiden ( Tabel 1 , https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ). Brugere kan kontakte support direkte eller sende spørgsmål på Ask CyVerse (ask.cyverse.org/) for at fejle eventuelle problemer med workflow.
I DE findes der flere apps for at gennemføre hvert trin i denne protokol. For eksempel kan brugere ønsker at køre Scythe (https://github.com/najoshi/sickle) i stedet for Trimmomatic15 for læsning eller kørsel EdgeR 16 i stedet for DESeq 17 , 18 . Selv uden for dette manuskripts anvendelsesområde kan DE apps kopieres, redigeres og udgives af brugere (https://wiki.cyverse.org/wiki/display/DEmanual/Creating,+Copying,+and+Editing+DE+ Apps) eller nye apps kan tilføjes af brugere (https://wiki.cyverse.org/wiki/display/DEmanual/Dockerizing+Your+Tools+for+the+CyVerse+Discovery+Miljøet). Atmosfæren billeder kan også ændres og reimaged for at skabe nye eller ændrede workflows, der matcher brugernes behov mere specifikt (https://wiki.cyverse.org/wiki/x/TwHX). Dette arbejde tjener som en introduktion til at udnytte kommandolinjen til at flytte data og udføre analyser. Brugere kan overveje at udnytte mere avancerede kommandolinje ressourcer, såsom CyVerse Application Programming Interfaces (API'er) (http://www.cyverse.org/science-apis) eller at designe deres egne DE apps, som kræver videnOm, hvordan analyseværktøjet køres på kommandolinjen (https://wiki.cyverse.org/wiki/display/DEmanual/Creating+a+New+App+Interface).
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge funding from USDA-NIFA grant 2013-00984, NSF grant IOS – 1339156, IOS – 1444490, and CyVerse (NSF: DBI – 1265383).
Trimmomatic v0.33 | USADELLAB.org | https://github.com/timflutre/trimmomatic | https://de.iplantcollaborative.org/de/?type=apps&app-id=9c2a30dc-028d-11e6-a915-ab4311791e69 |
Sickle | Joshi and Fass | https://github.com/najoshi/sickle | https://de.iplantcollaborative.org/de/?type=apps&app-id=68b278f8-d4d6-414d-9a64-b685a7714f7c |
Trinity | Broad Institute and Hebrew University of Jersalem | https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki | https://atmo.iplantcollaborative.org/application/images/1261 |
rnaQUAST v1.2.0 | Algorithmic Biology Lab, St. Petersburg Academic University of the Russian Academy of Sciences | http://spades.bioinf.spbau.ru/rnaquast/release1.2.0/manual.html | https://de.iplantcollaborative.org /de/?type=apps&app- id=980dd11a-1666-11e6-9122- 930ba8f23352 |
Transdecoder | Broad Institute and Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | https://transdecoder.github.io | https://de.iplantcollaborative.org/de/?type=apps&app-id=5a0ba87e-b0fa-4994-92a2-0d48ee881179 |
EdgeR | Robinson et al. 2010. | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeR.pdf | https://de.iplantcollaborative.org/de/?type=apps&app-id=5aa9e294-6f95-42f9-98e9-c9c96b44f499 |
Trinotate | Broad Institute and Hebrew University of Jersalem | https://trinotate.github.io/ | https://atmo.iplantcollaborative.org/application/images/1261 |