Chip-exo Metode: Identifisere Protein-DNA interaksjoner med nærheten basepar Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (chip) er et uunnværlig verktøy innen epigenetikk og genregulering som isolerer spesifikke protein-DNA interaksjoner. ChIP koplet til høy gjennomstrømming sekvensering (chip seq) blir ofte brukt for å bestemme den genomiske plassering av proteiner som interagerer med kromatin. Imidlertid er chip seq hemmet av forholdsvis lav oppløsning kartlegging av flere hundre basepar og høyt bakgrunnssignal. Chip-exo-metoden er en raffinert utgave av brikke seq som vesentlig bedrer på både oppløsning og støy. Den viktigste forskjellen av chip-exo metodikk er inkorporering av lambda eksonuklease fordøyelse i biblioteket fremstilling arbeidsflyt for effektivt å fotavtrykk venstre og høyre 5 'DNA-grenser protein-DNA-kryssbindende område. Brikken-exo-biblioteker blir deretter underkastet høy gjennomstrømming sekvensering. Den resulterende data kan utnyttes til å gi unike og ultra-høy oppløsning innsikt i den funksjonelle organiseringen of genomet. Her beskriver vi chip-exo metode som vi har optimalisert og strømlinjeformet for pattedyrsystemer og neste generasjons sekvensering-by-syntese plattform.
Introduction
Chromatin immunoprecipitation (chip) er en kraftig metode for å studere mekanismer for genregulering av selektivt berikende for DNA-fragmenter som samhandler med en gitt protein i levende celler. Deteksjonsmetoder chip-beriket DNA-fragmenter har utviklet seg som teknologien forbedres, fra deteksjon av en enkelt locus (standard chip qPCR) til hybridisering på oligonukleotid mikromatriser (Chip-chip) til high-throughput sekvensering (Chip-seq) 1. Selv ChIP-seq har sett utbredt anvendelse, kromatin heterogenitet og uspesifikke DNA interaksjoner har hemmet datakvalitet fører til falske positive og upresis kartlegging. For å omgå disse begrensningene, Dr. Frank Pugh utviklet chip-exo metode 2. Det fremtredende trekk chip-exo er at det inneholder en 5 'til 3' eksonuklease, effektivt spor transkripsjonsfaktorbindende steder. Som et resultat, oppnår chip-exo metodikk høyere oppløsning, større dynamisk område på deteksjon, og lavere bakgrunnsstøy.
Selv ChIP-exo er mer teknisk utfordrende å mestre enn chip seq, er det å bli allment vedtatt som studier tar sikte på å få unike ultrahøy oppløsning innsikt ved hjelp av ulike biologiske systemer 3-8. Faktisk har ChIP-exo blitt brukt til bakterier, gjær, mus, rotte og humane cellesystemer. Som bevis på prinsippet ble chip exo opprinnelig ble brukt til å identifisere den nøyaktige bindingsmotiv for en håndfull av gjær transkripsjonsfaktorer to. Teknikken ble også brukt i gjær for å studere organiseringen av transkripsjons pre-initiering kompleks, og for å dechiffrere subnucleosomal struktur av forskjellige histoner 9,10. Flere nylig, leveraged Vi chip-exo å løse tilstøtende TFIIB og Pol II bindende hendelser på menneske arrangører, og viste at utbredt divergerende transkripsjon oppstår fra distinkt initiering komplekser 11.
Arbeidsflyten som presenteres her er optimalisert og streamlined for pattedyr ChIP-exo (figur 1). For det første er bor primære eller vevskultur-cellene behandlet med formaldehyd for å bevare in vivo protein-DNA-interaksjoner gjennom en kovalent tverrbinding. Cellene lyseres og kromatin skåret til ~ 100 – 500 basepar størrelse fragmenter. ChIP så selektivt beriker for DNA-fragmenter tverrbindes til proteinet av interesse. På dette punktet, er chip-seq biblioteker typisk fremstilt, som i seg selv begrenser deteksjonsoppløsningen til den gjennomsnittlige fragmentstørrelse på noen få hundre basepar. Men seirer ChIP-exo denne begrensningen ved å klippe venstre og høyre 5 'DNA grenser protein-DNA kryssbindingsstedet med lambda eksonuklease. Sekvense bibliotekene blir deretter konstruert fra eksonuklease fordøyd DNA som beskrevet nedenfor. De resulterende nestede 5 'grenser representerer et in vivo-fotavtrykk av protein-DNA interaksjon (Figur 1, trinn 14), og blir detektert ved høy gjennomstrømning sekvensering. altHough chip-exo metodikk er mer involvert enn chip seq, overganger mellom de fleste trinnene krever enkel perle vask, noe som minimerer prøvetap og eksperimentell variabilitet. Viktigere, siden chip exo er en raffinert utgave av chip seq, enhver prøve som er vellykket med Chip-seq bør også være vellykket med Chip-exo.
In vivo footprinting av protein-DNA interaksjoner med Chip-exo resulterer i en fundamentalt forskjellig datastruktur fra ChIP-seq. Selv om vanlige Chip-seq innringere kan brukes til å chip-exo data, for å få tak i de mest presise rushsamtaler anbefaler vi bioinformatikk spesielt utviklet med den unike strukturen chip-exo data i tankene. Disse inkluderer Gene, GEM, MACE, Peakzilla, og ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer en funksjonell genomikk protokoll for å fastslå nøyaktig binding stedet for kromatin samspill proteiner på en objektiv, genom-wide måte på nær basepar oppløsning. Den mest kritiske trinn for å oppnå nær basepar kartlegging oppløsning er den eksonuklease behandling av chip-anrikede DNA mens immunpresipitatet forblir på den magnetiske harpiks. Tilsynelatende, kan protein komplekser potensielt blokkere in vivo footprinting av enhver underenhet (f.eks kromatin remodeling k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
