Chipet-exo Metod: Identifiera protein-DNA interaktioner med nära baspar Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (chip) är ett oumbärligt verktyg inom epigenetik och genreglering som isolerar specifika protein-DNA-interaktioner. ChIP kopplad till hög genomströmning sekvensering (chip-seq) används ofta för att bestämma den genomiska lokaliseringen av proteiner som interagerar med kromatin. Dock är Chip-punkter hindras av relativt låg kartläggning upplösning av flera hundra baspar och hög bakgrundssignal. Chipet-exo metoden är en förfinad version av Chip-punkter som väsentligt förbättrar både upplösning och buller. Den viktigaste skillnaden av chip-exo metodik är införlivandet av lambda exonukleas nedbrytning i beredningen bibliotek arbetsflöde för att effektivt fotavtryck vänster och höger 5 'DNA-gränser protein DNA tvärbindningsplatsen. Chipet-exo bibliotek utsätts sedan för hög genomströmning sekvensering. Den resulterande data kan utnyttjas för att ge unika och extremt hög upplösning insikter i den funktionella organisationen of genomet. Här beskriver vi chip-exo metod som vi har optimerat och rationaliseras för däggdjurssystem och nästa generations sekvensering genom syntes plattform.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (chip) är en kraftfull metod för att studera mekanismer för genreglering genom att selektivt anrika för DNA-fragment som interagerar med ett givet protein i levande celler. Detektionsmetoder chip-berikat DNA-fragment har utvecklats som tekniken förbättras, från upptäckt av en enda locus (standard Chip-qPCR) hybridisering på oligonukleotid microarrays (chip-chip) och hög genomströmning sekvensering (chip-punkter) 1. Även Chip-punkter har sett utbredd tillämpning, kromatin heterogenitet och ospecifika DNA-interaktioner har försvårat datakvalitet leder till falska positiva och oprecisa kartläggning. För att kringgå dessa begränsningar, Dr. Frank Pugh utvecklade chip-exo metod 2. Det framträdande särdrag av ChIP-exo är att den innehåller en 5 'till 3' exonukleas, vilket effektivt footprint för transkriptionsfaktorbindningsplatser. Som ett resultat uppnår Chip-exo metodik högre upplösning, större dynamiskt omfång av detection, och lägre bakgrundsbrus.
Även Chip-exo är mer tekniskt utmanande att bemästra än Chip-punkter, är det i stor utsträckning antagits som studier syftar till att få unika ultrahög upplösning insikter med hjälp av olika biologiska system 3-8. I själva verket har Chip-exo framgångsrikt tillämpats på bakterier, jäst, mus, råtta och humana cellsystem. Som bevis i princip var Chip-exo ursprungligen användes för att identifiera den exakta bindningsmotiv för en handfull jäst transkriptionsfaktorer 2. Tekniken användes även i jäst för att studera organisationen av transkriptions före initiering komplex och att dechiffrera subnucleosomal struktur av olika histoner 9,10. På senare tid, belånade vi Chip-exo att lösa intilliggande TFIIB och Pol II bindande händelser på mänskliga promotorer, och visade att utbredd avvikande transkription beror tydlig initiering komplex 11.
Arbetsflödet som presenteras här är optimerad och streamlined för däggdjur Chip-exo (Figur 1). Först, lever primära eller vävnadsodlingsceller som behandlats med formaldehyd för att bevara in vivo-protein-DNA-interaktioner genom en kovalent tvärbindning. Cellerna lyseras och kromatin klippt till ~ 100 – 500 baspar storlek fragment. ChIP sedan selektivt berikar för DNA-fragment tvärbundna till proteinet av intresse. Vid denna punkt, är ChIP-seq bibliotek framställs typiskt, som i sig begränsar upplösningen detekteringen till den genomsnittliga fragmentstorleken av några hundra baspar. Men vinner Chip-exo denna begränsning genom att trimma vänster och höger 5 'DNA-gränser protein DNA tvärbindning plats med lambda exonukleas. Sekvense bibliotek konstrueras sedan från exonukleas nedbrutna DNA: t enligt nedan. De resulterande kapslade 5 "gränser representerar en in vivo-footprint av proteinet-DNA interaktion (figur 1, steg 14), och detekteras av hög genomströmning sekvensering. altHough chip-exo metodik är mer engagerade än Chip-punkter, övergångar mellan de flesta steg kräver enkel pärla tvätt, vilket minimerar provförlust och experimentell variabilitet. Viktigt, eftersom chip-exo är en förfinad version av Chip-punkter, något prov som är framgångsrik med Chip-punkter bör också vara framgångsrika med Chip-exo.
In vivo-footprinting av protein-DNA-interaktioner med Chip-exo resulterar i en i grunden skiljer datastruktur från Chip-punkter. Även vanliga Chip-punkter som ringer kan appliceras på Chip-exo data, för att få de mest exakta topp samtal rekommenderar vi bioinformatiska verktyg särskilt utformade med den unika strukturen av Chip-exo data i minnet. Dessa inkluderar Genetrack, GEM, muskotblomma, Peakzilla och ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar en funktionell genomisk protokoll för att fastställa den exakta bindnings plats för kromatin interagerande proteiner i en opartisk, genomet hela sätt på nära baspar upplösning. Det mest kritiska steget för att uppnå nära baspar kartläggningsupplösning är den exonukleasbehandling av chip-anrikade DNA medan den immunfällningen kvar på det magnetiska hartset. Skenbart kan proteinkomplex potentiellt blockera in vivo fotavtryck av en viss subenhet (t.ex. kromatinremodelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
