Kapillær mater analysen Måler matinntak i<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Abstract

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

Introduction

Å spise er viktig; Men deregulering av matinntak fører til spiseforstyrrelser som bulimi, anoreksi eller generell tendens til å overspise pålegger koster på individ og samfunn ^{1, 2, 3.} Målet for den foreliggende forskning er å avdekke reguleringsmekanismer av matinntak og gi en strategi for å omgå uorden formasjonen. Tallrike studier med pattedyrmodellorganismer har gitt ny innsikt i kretsene og rollen til signalanlegg i spiseforstyrrelser ^{4, 5, 6.} Likevel, vår kunnskap om nevronale og molekylære baser bak disse lidelser er fortsatt langt fra komplett. I de siste årene har bananflue Drosophila melanogaster har blitt en verdifull modellsystem for å rakne grunn mekanistiske innsikt i reguleringen av metabolism ^{7, 8, 9.} Kapillær mater (CAFE) assay for Drosophila melanogaster ble etablert i laboratoriet av Seymour Benzer i 2007 inspirert av en tidligere arbeid av Dethier i spyflue ^{10, 11.} Kafeen analysen gjorde det mulig å direkte måle matinntaket i Drosophila melanogaster. I denne atferds teste systemet, fluer lever av flytende mat levert på graderte glass kapillærer plassert inne i et hetteglass. Nedgangen av kapillaren menisken indikerer tap av mat oppløsning via fordampning og matforbruk. Bestemme fordampingen av ampuller uten fluer tillater nøyaktig kvantifisering av matinntak.

Kafeen analysen er en av flere atferds paradigmer som brukes til å måle fôring i Drosophila melanogaster og forskere må velge den som passer best for deres spesifikkespørsmål. Beslutningen om å bruke en viss analyse bør vurdere følgende punkter: innholdet i maten gitt; fôring tilstand; måling av inntak eller opptak av næringsstoffer og undersøkelse matforbruk, eller som reaksjon på mat.

Kafeen analyse som beskrevet i denne rapporten er ideell for å følge mat inntak av en væske matkilde under en oppreist fôring tilstand. Alternativt matinntaket kan måles for en flue gruppe på en farget matkilde i en ampulle eller på en plate. Fluer er vanligvis drept eller bedøvet etter mating og mengden av inntatt fargestoff blir bestemt ved spektrofotometri eller visuell inspeksjon av farget magen. Fluer begynner å skille ut den inntatt mat bare 30 minutter etter inntak, derfor er denne tilnærmingen er vanskelig å benytte for analyse av kontinuerlige lengre foring Adferd ^{12, 13.}

I motsetning fluer holdes intakt når absorberbare fargestoffs med radioaktive tracere brukes og sitt forbruk av radioisotop er scoret i en scintillasjonsteller ^{14, 15.} Absorpsjon av radiomerkingen av fly fordøyelsessystemet gjør langsiktig mat opptak måling mulig, men kan føre til underestimering av forbruket på grunn av ikke-absorbert og utskilles tracer molekyler. En annen tilnærming til å måle respons på mat i bananflue er snabel forlengelse respons (PER), som normalt gjelder for matinntak ^16. Denne elegante metoden måler den første reaksjon på en matvare stimulans, men registrerer ikke mengden av inntaket. Matinntak justeres dynamisk under fôring ved hjelp av flere etterfordøyelsestilbakemeldingssignaler som er kritiske for regulering av fôring ^{17, 18.} Flere forsøk har blitt gjort i senere år for å halvautomatisere datainnsamling i PER assay <sopp class = "xref"> ^{19, 20.} Den PER blir detektert av en elektrisk pute eller en kombinasjon av elektroder og telles via datamaskinen. Ved å kombinere den PER analysen med radio-isotopopptak avslørte at denne metoden er begrenset ved lav følsomhet til å detektere mengde forings forskjeller ^18. Den manuelle mating assay (mafe) ^21, i hvilken en flue mates manuelt med et glasskapillar, ble nylig utviklet for å måle mat-opptak i en enkelt immobilisert fly. Den mafe assay eliminerer forstyrrelser av beite og mating initiering og har en tidsoppløsning på sekunder, og initiering av PER og matforbruk kan overvåkes uavhengig i analysen. Men på hvilken måte immobilisering av flua påvirker visse aspekter ved fôring atferd (f.eks bevegelse, motivasjon) fortsatt trenger å bli undersøkt. For gode komparative vurderinger av ulike analyser for å måle matforbruket i Drosophila meglanogaster og for å hjelpe forskere med å finne den som passer best, se rapporter fra Deshpande og Marx ^{13, 22.}

Kafeen analysen unngår noen av ulempene ved andre analysene beskrevet ovenfor, og kombinerer enkelhet i bruk med pålitelig måling av matinntak. Her er en detaljert beskrivelse av CAFE analysen gitt og vi viser et enkelt oppsett modifikasjon for å redusere fordampning. Representative resultater, inkludert en to mat valg analysen (kort og lang sikt) og sukrose opptak av fluer er demonstrert. I diskusjonen sammenligner vi vår beskrev metoden med alternative måter å utføre den CAFE analysen, og synliggjør mulige begrensninger.

Protocol

1. CAFE analysen MERK: Analysen består av tre komponenter: en eksperimentell hetteglass, en bestemt lokk og mikrokapillærer. En plastboks med deksel brukes til å transportere de preparerte ampuller og for å kontrollere fuktigheten mer effektivt. Bruke et Drosophila melanogaster kultur plastampulle (valgfritt 8 cm høyde, 3,3 cm diameter) som et rør for analysen. Forsegl flasken med en produsert pleksiglasslokk inneholdende en O-ring (figur 1A, 1B).<…

Representative Results

Fluer w 1118 genotype anvendes for å demonstrere hvordan analysen er utført. De w 1118 mutantene blir ofte brukt til å generere transgene linjer, og for å styre den genetiske bakgrunn av transgener som er merket med hvit-genet. Normalt, for atferdsmessige eksperimenter, blir alle transgene linjer backcrossed i fem generasjoner til den samme w 1118 lager, som brukes som en eksperimentell kontroll. Vi viser forskjelli…

Discussion

Rapporten beskriver CAFE analysen i en steg-for-steg måte, med fokus på det tekniske oppsettet og sin vellykkede resultater i laboratoriet. På grunn av sin enkelhet, kan dette assay også kan brukes pedagogisk som en skole eksperiment. Eksemplene viser at analysen tillater undersøkelse av mat sensing, preferanse og forbruk i Drosophila melanogaster over korte og lengre tidsperioder (timer eller dager). Kafeen analysen har blitt brukt mye i feltet for å undersøke emner, inkludert mat og narkotikabruk, avhe…

Materials

Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x29 x18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer`s Yeast			299.33 g
Cornmeal			1200g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL