Imagerie en direct pour l'étude microtubules Instabilité dynamique dans les cancers du sein taxane-résistantes

Résumé

Dans cet article, nous rapportons un protocole décrivant une méthode in vivo pour mesurer l’instabilité dynamique des microtubules dans les cellules cancéreuses du sein résistantes au docétaxel (MCF-7_TXT). Dans cette méthode, un système d’imagerie par microscopie à déconvolution est utilisé pour détecter l’expression de la GFP-tubuline dans les cellules cibles.

Résumé

Les taxanes tels que le docétaxel appartiennent à un groupe d’agents ciblant les microtubules (MTA) qui sont couramment utilisés pour traiter le cancer. Cependant, la résistance aux taxanes dans les cellules cancéreuses réduit considérablement l’efficacité de l’utilisation à long terme des médicaments. Les preuves accumulées suggèrent que les mécanismes sous-jacents à la résistance aux taxanes comprennent à la fois des mécanismes généraux, tels que le développement de la multirésistance aux médicaments due à la surexpression des protéines d’efflux de médicaments, et des mécanismes spécifiques aux taxanes, tels que ceux qui impliquent la dynamique des microtubules.

Parce que les taxanes ciblent les microtubules cellulaires, la mesure de l’instabilité dynamique des microtubules est une étape importante pour déterminer les mécanismes de résistance des taxanes et donne un aperçu de la façon de surmonter cette résistance. Dans l’expérience, une méthode in vivo a été utilisée pour mesurer l’instabilité dynamique des microtubules. La α-tubuline marquée à la GFP a été exprimée et incorporée dans les microtubules des cellules MCF-7, ce qui a permis d’enregistrer la dynamique des microtubules par laps de temps à l’aide d’une caméra sensible. Les résultats ont montré que, contrairement aux cellules_parentales MCF-7 CC non résistantes, la dynamique des microtubules des cellules_{MCF-7 TXT} résistantes au docétaxel est insensible au traitement au docétaxel, ce qui provoque la résistance à l’arrêt mitotique induit par le docétaxel et à l’apoptose. Cet article décrit cette méthode in vivo de mesure de l’instabilité dynamique des microtubules.

Introduction

La principale cause de mortalité par cancer du sein est par métastase ^{1, 2.} Taxanes, tels que le docétaxel et le paclitaxel, sont actuellement utilisés comme schémas de première intention dans le traitement du cancer du sein métastatique , ^{2, 3, 4, 5, 6.} Ils font partie d'un groupe d'agents de microtubules-ciblage (ATM) qui perturbent la dynamique des microtubules. Cependant, l' un des plus grands défis à l' utilisation de tax....

Protocole

1. Préparation des cellules pour l'imagerie en direct

1. La culture cellulaire et l' ensemencement
   1. Utiliser des cellules MCF-7 du cancer du sein sélectionnées pour la résistance au docétaxel (MCF-7 _TXT) et leur lignée cellulaire parentale non résistante (MCF-7 _CC). Le processus de sélection et la caractérisation détaillée de ces lignées cellulaires sélectionnées ont été décrites précédemment ^24.
   2. Cultiver les cellules dans des boîtes de culture de 10 cm à 37 ° C dans un milieu composé de 90% de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et 10% de sérum d....

Résultats

En utilisant le protocole présenté ici, nous avons étudié les effets de docétaxel sur la dynamique des microtubules de la normale (MCF-7 _CC) et le docétaxel résistant (MCF-7) _TXT cellules de cancer du sein. Deux séries d'images montrent les effets de docétaxel (0,5 uM) sur la croissance et le raccourcissement des microtubules dans les cellules MCF-7 _CC et MCF-7 _TXT cellules (figure 1A).

Discussion

Il existe deux méthodes principales pour mesurer microtubules instabilité dynamique: in vitro et in vivo. Dans le procédé in vitro, la tubuline purifiée est utilisée pour mesurer l' instabilité microtubules dynamique avec time-lapse interférence différentielle-microscopie à contraste amélioré par ordinateur. Dans le procédé in vivo, microinjecté tubuline fluorescente ou exprimé GFP-tubuline en microtubules est incorporé. La dynamique (croissance et de raccourcissement) des microtu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Acides aminés non essentiels	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docétaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM sans rouge de phénol	Gibco, Invitrogen	21063
Réactif CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubuline	ThermoFisher Scientific	C10613	Réactif clé pour l’expression de la tubuline GFP dans les cellules
CellLight Réactif *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Contrôle
diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9 :AA9	472301	pour dissoudre le decetaxel
22 mm verre coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
Plaque de culture 6 puits	Greiner Bio-One International		culture Celi 6 puits
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		Ce système est équipé d’une station météo pour le contrôle de la température et du CO2. Il est également équipé du logiciel Worx pour la déconvolution et le contrôle en accéléré.
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific Hausser	Scientific, distribué par VWR	N° de fournisseur : 1492 N° VWR : 15170-172

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