Dissektion og Observation af Honey Bee Dorsal Vessel for Studier af hjertefunktion

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

Det overordnede mål med denne metode er at give undersøgeren for hurtigt og nemt observere og kvantificere den virkning, at et farmakologisk middel har på pulsen af ​​honningbier. Bier, ligesom andre insekter, har et åbent kredsløb, der udbreder hemolymph, insekt ækvivalent af blod, hele kroppen hulrum, kendt som hemocoel. Cirkulationen af hæmolymfe er nødvendige for transport af næringsstoffer, immunstoffer, affaldsprodukter, samt neurohormones og andre signalmolekyler ^1. Cirkulation lettes af den dorsale fartøj, der strækker sig langs den dorsale midtlinie insektets, samt accessoriske pulserende organer. Den dorsale fartøj er opdelt i to funktionelt forskellige sektioner, betegnet hjertet i maven og aorta i brystkassen og hovedet. Opformerede sammentrækninger i hjertet pumpe hæmolymfe mod brystkassen og hovedet, mens tilbehør pulserende organer sikrer hemolymph flow til ekstremiteterne.

<pclass = "jove_content"> Insect hjertefunktion kan observeres ved anvendelse af en række fremgangsmåder, afhængigt af størrelsen, fysiologi eller livet etape af insekt. En fælles tilgang til at observere puls i larver eller mindre insekter er brugen af intravital billeddannelse ^2. Denne metode er mindre nyttigt i voksne bier, dog, som det kan være vanskeligt klart at se den dorsale beholderen gennem bugvæggen. En etableret fremgangsmåde til optagelse puls i en række forskellige insekter, herunder bier, er brugen af kontakt termografi, som anvender termistorer anvendes på det ydre af insektet til at detektere kardiale pulsationer ^3,4. Puls hos voksne bier er også blevet registreret ved hjælp af en elektrofysiologisk teknik til at måle en elektrisk impedans signal ^4,5. Denne teknik kræver indsættelse af elektroder i dyret ved siden af hjertet og brug af en impedans-konverter til at registrere hjerteslag ^4. Tilsvarende er elektrokardiogram blevet anvendt til at DETECt elektriske signaler produceret af hjerte og kombineret med videooptagelse af bi at observere ændringer i hjerteaktivitet ^6. En klar fordel for disse tilgange er, at pulsen er vurderet i en intakt, levende bi, snarere end i en dissekeret prøve, som er med til at sikre tilgængeligheden af ​​hele spektret af fysiologiske reaktioner i emnet. Udfordringerne i disse tilgange omfatter regnskab for immobilisering eller bedøvelse af emnet, at det er nødvendigt at begrænse eksterne variabler og stimuli, der kan ændre puls, samt bestemmer en passende leveringsmetode ved test farmakologiske agenter.

En anden fremgangsmåde, der har været anvendt til undersøgelse af bi hjerteaktivitet er at delvist dissekere insektet for at blotlægge hjertet, derefter måle dorsale fartøj sammentrækninger med en kraft forskydningstransducer ^7. I denne protokol, er hjertet kontinuerligt badet med rindende fysiologisk saltvand og test compounds kan opløses i denne opløsning for ansøgning til emnet ^7. En væsentlig forskel mellem denne fremgangsmåde og de tidligere beskrevne er, at den ventrale nerve ledningen er fjernet, hvilket eliminerer den rolle, det centrale nervesystem har vist sig at spille i modulering puls ^5. Resultatet er, at den basislinje hjerteslag, som normalt er ganske uberegnelig, stabiliserer ved en meget lavere frekvens og amplitude end der er normalt i en levende insekt ^5,7. Hvad alle disse metoder har til fælles er, at de kræver højt specialiseret og ofte dyre udstyr, ud over et vist niveau af ekspertise, for at blive gennemført. Måske er den største ulempe er, at ingen af ​​disse tilgange er særdeles velegnede til eksperimenter, der indgår forsøg et stort antal patienter, såsom screening af et bibliotek af potentielt cardiomodulatory forbindelser.

Den største styrke af den fremgangsmåde, der er beskrevet herer dets enkelhed. Protokollen er relativt let at mestre, opsætningen kræver lidt plads, og kun en minimal økonomisk input er nødvendig. Fremgangsmåden kræver lidt mere end nogle bier, et par kirurgiske instrumenter, en isotonisk opløsning, og enten en digital mikroskop eller en traditionel mikroskop med et digitalt kamera. Bier dissekeres at visualisere den dorsale fartøj og digitale videoer bruges til at registrere pulsen før og efter behandling med farmakologiske midler. Selvom videooptagelse er faktisk ikke nødvendigt at observere ændringer i hjertefrekvensen, vil det i høj grad øge throughput (dvs. antallet af emner, der kan behandles i en given mængde tid). Investigator kan maksimere effektiviteten ved at optage et stort antal videoer på én gang, og så senere udføre disse videoer på et mere belejligt tidspunkt. En anden fordel ved denne fremgangsmåde er, at videoer tillader investigator at starte forfra, bør scoring processen afbrydes, og gøre det lettere for viewer skal blindet for behandlingen for at reducere skævhed.

Protocol

1. Indsamling og klargøring af testpersoner Saml det nødvendige antal bier fra kolonien. BEMÆRK: Antallet behov afhænger ikke kun størrelsen og omfanget af forsøget, men også dygtighed af investigator. For eksempel, hvis der er 2 behandlingsgrupper med en ønsket prøvestørrelse på 10 bier pr gruppe, kan en rimelig dygtig investigator indsamle mindst 30 bier at tage højde for mislykkede dissektioner og ender med 20 nyttige videoer at score. Minimer den tid der går mellem indsamling…

Representative Results

Da mange af de farmakologisk aktive forbindelser, der kan testes under anvendelse af denne protokol er ikke opløselige i vand, er det nødvendigt at have en pålidelig opløsningsmiddel, som vil gøre det muligt testforbindelser der skal leveres via isotonisk opløsning, der anvendes til at bade den dorsale fartøj. Dimethylsulfoxid (DMSO) er et opløsningsmiddel, der er almindeligt anvendt som et middel til at levere eksperimentelle lægemidler og andre forbindelser i dyr 8,…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments