Dissekering och Observation Honey Bee Rygg fartyg för studier av hjärtfunktionen

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att göra det möjligt för forskaren att snabbt och enkelt observera och kvantifiera effekten som en farmakologisk agent har på hjärtfrekvensen av honungsbin. Bin, liksom andra insekter, har ett öppet cirkulationssystem som sprider hemolymfa, insekten motsvarande blod i hela kroppen hålighet, känd som hemocoel. Spridningen av hemolymph är nödvändiga för transport av näringsämnen, immun faktorer, avfall, samt neurohormoner och andra signalmolekyler ^1. Cirkulationen underlättas av den dorsala kärlet, som sträcker sig längs ryggens mittlinje av insekt, liksom accessoriska pulserande organ. Den dorsala kärlet är uppdelat i två funktionellt distinkta sektioner, betecknad hjärtat i buken och aorta i bröstkorgen och huvudet. Förökade sammandragningar i hjärtpump hemolymfa mot bröstkorgen och huvudet, medan tillbehörspulserande organ säkerställa hemolymph flöde till armar och ben.

<pclass = "jove_content"> kan observeras Insect hjärtfunktionen genom att använda en rad olika metoder, beroende på storleken, fysiologi, eller livet skede av insekten. En gemensam strategi för att observera puls i larver eller mindre insekter är användningen av intravital avbildning ^2. Denna metod är mindre användbara i vuxna bin, men eftersom det kan vara svårt att tydligt visa den dorsala kärlet genom bukväggen. Ett etablerat tillvägagångssätt för registrering av hjärtfrekvensen i en mängd olika insekter, inklusive bin, är användningen av kontakttermografi, som utnyttjar termistorer appliceras på det yttre av insekten för att detektera hjärtpulsationer ^3,4. Hjärtfrekvens hos vuxna bin har också spelats in med en elektrofysiologisk teknik för att mäta en elektrisk impedans signal ^4,5. Denna teknik kräver insättning av elektroder i djuret intill hjärtat och användningen av en impedansomvandlare för att spela in hjärtslag ^4. På liknande sätt har elektrokardiogram använts för att DETECt elektriska signaler som alstras av hjärtat och i kombination med videoinspelning av biet att observera förändringar i hjärtaktivitet ^6. En tydlig fördel med dessa metoder är att hjärtfrekvensen bedöms i en intakt, levande bi, snarare än i en dissekeras prov, vilket bidrar till att säkerställa tillgången till ett komplett utbud av fysiologiska svar i ämnet. De utmaningar som dessa metoder inkluderar redovisning för immobilisering eller bedövning av ämnet, behovet av att begränsa utanför variabler och stimuli som kan ändra puls, samt fastställa en lämplig leveransmetod vid testning farmakologiska medel.

En annan metod som har använts för att studera bee hjärtaktivitet är att delvis dissekera insekten för att exponera hjärtat, sedan mäta dorsala fartygs sammandragningar med en kraft förskjutningsgivare ^7. I detta protokoll, är hjärtat ständigt badade med rinnande fysiologisk saltlösning och prov compounds kan upplösas i denna lösning för applicering på ämnet ^7. En signifikant skillnad mellan denna metod och de som tidigare beskrivits är att den ventrala nervsträngen avlägsnas, vilket eliminerar den roll som det centrala nervsystemet har visat sig spela vid modulering av hjärtfrekvensen ^5. Resultatet är att baslinjen hjärtslag, vilket är oftast ganska ojämn, stabiliseras på en mycket lägre frekvens och amplitud än normalt observeras i en levande insekt ^5,7. Vad alla dessa metoder har gemensamt är att de kräver högt specialiserad och ofta dyr utrustning, förutom en viss nivå av kompetens, för att kunna genomföras. Kanske den största nackdelen är att ingen av dessa metoder särskilt väl lämpade för experiment som omfattar försök ett stort antal ämnen, såsom screening av ett bibliotek av potentiellt cardiomodulatory föreningar.

Den största styrkan i det tillvägagångssätt som beskrivs härär dess enkelhet. Protokollet är relativt lätt att bemästra, installationen kräver lite utrymme, och endast en minimal finansiell ingång är nödvändigt. Metoden kräver lite mer än några bin, några kirurgiska instrument, en isoton lösning, och antingen en digital mikroskop eller ett traditionellt mikroskop med en digital kamera. Bin dissekeras att visualisera ryggkärlet och digital video används för att mäta puls före och efter behandling med farmakologiska medel. Även videoinspelning är faktiskt inte nödvändigt att observera förändringar i hjärtfrekvens, kommer det att kraftigt öka genomströmningen (dvs antal ämnen som kan behandlas i en viss tid). Utredaren kan maximera effektiviteten genom att spela in ett stort antal filmer på en gång och sedan scoring dessa filmer på en mer lämplig tidpunkt. En annan fördel med denna metod är att videor låta utredaren att börja om från början, bör poängprocessen avbryts, och göra det lättare för viewer förblindas till behandlingen i syfte att minska bias.

Protocol

1. Insamling och förberedelse av Försökspersoner Samla lämpligt antal bin från kolonin. OBS: Antalet behövs beror på inte bara storleken och omfattningen av experimentet, men också skicklighet utredaren. Till exempel, om det finns 2 behandlingsgrupper med en önskad stickprovsstorlek på 10 bin per grupp, kan en någorlunda kompetent utredare samla minst 30 bin redogöra för misslyckade dissektioner och sluta med 20 användbara videoklipp att göra mål. Minimera den tid som passerar…

Representative Results

Eftersom många av de farmakologiskt aktiva föreningarna som kan testas med användning av detta protokoll är inte lösliga i vatten, är det nödvändigt att ha en tillförlitlig lösningsmedel som kommer att tillåta testföreningar som skall levereras via isoton lösning används för att bada den dorsala kärlet. Dimetylsulfoxid (DMSO) är ett lösningsmedel som ofta används som en vehikel för avgivning av experimentella läkemedel och andra föreningar i djur 8, och d…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments