Denne protokol beskriver en robust, reproducerbar og enkel fremgangsmåde til isolering og dyrkning af myoblast progenitorceller fra skeletmuskel af voksne og ældre mennesker. De muskler, der anvendes her, omfatter fod og ben muskler. Denne tilgang muliggør isolering af en beriget population af primære myoblaster for funktionelle studier.
Skeletal muscle homeostase afhænger muskelvækst (hypertrofi), atrofi og regenerering. Under aldring og i adskillige sygdomme, muskelsvind forekommer. Tab af muskelmasse og funktion er associeret med muskelfibertypesammensætningen atrofi, fibertype switching, defekt muskel regenerering forbundet med dysfunktion af satellit-celler, muskel stamceller og andre patofysiologiske processer. Disse ændringer er forbundet med ændringer i intracellulært samt lokale og systemiske nicher. Ud over de hyppigst anvendte gnavermodeller for muskel aldring, er der behov for at studere muskel homeostase og spilder anvendes humane modeller, der på grund af etiske implikationer, består overvejende af in vitro kulturer. På trods af den brede anvendelse af menneskelige myogene progenitorceller (MPCS) og primære myoblaster i myogenese, er der begrænsede data om brugen af humane primære myoblast og myotube kulturer til at studere molekylære mekanismer der regulerer forskellige aspekter af alder-associeret muscle spilde, medvirken i validering af mekanismerne for aldring foreslået i gnaver muskel. Brugen af menneskelige Middelhavspartnerlandene, primære myoblaster og myorør isoleret fra voksne og ældre mennesker, giver en fysiologisk relevant model af molekylære mekanismer i processer forbundet med muskelvækst, atrofi og regeneration. Her beskriver vi detaljeret en robust, billig, reproducerbar og effektiv protokol til isolering og opretholdelse af humane Middelhavspartnerlandene, og deres afkom – myoblaster og myorør fra human muskel prøver under anvendelse enzymatisk fordøjelse. Endvidere har vi bestemt passage nummer, hvor primære myoblaster fra voksne og ældre mennesker undergår ældning i en in vitro-dyrkning. Endelig viser vi evnen til at transficere disse myoblaster og evnen til at karakterisere deres proliferative og differentiering kapacitet og foreslå deres egnethed til at udføre funktionelle studier af molekylære mekanismer myogenese og muskelsvind in vitro. </p>
Sygdoms- og aldersrelateret progressivt tab af skelet muskelmasse og funktion resulterer i skrøbelighed, nedgang i styrke og fald i livskvalitet ældre mennesker. Skeletal muscle tegner sig for ca. 40% kropsmasse 1. Under ældning og sygdom, progressiv atrofi af individuelle myofibre og reduktion af muskel kvalitet på grund af infiltration af fedt og fibrose forekommer 1, 2, 3, 4, 5, 6. For nylig er det blevet foreslået, at artsspecifikke forskelle i ældning af skeletmuskulatur forekomme, specifikt, at muskelfibrene tab, der opstår hos gnavere, kan ikke finde sted hos mennesker 7. Ikke desto mindre er de tilbageværende muskelfibre af alderen pattedyr karakteriseret ved øget modtagelighed for beskadigelse og nedsat regenerering <supclass = "xref"> 8. Voksen muskel reparation og vedligeholdelse er medieret af satellit celler 9, 10. Ved muskelskader og andre relevante stikord, satellit celler bliver aktiveret og formere sig. En delmængde af cellerne tilbage til den hvilende tilstand og resten skrider ind myoblaster (Myogenic progenitorceller – MPCS). Disse bidrager til reparation af den eksisterende myofiber 11. Funktionaliteten af satellit-celler er afgørende for succes af muskel regenerering og ændringerne i satellit celle tilgængelighed med aldring er påvist 12, 13, 14, 15. Endvidere satellitceller fra musklen af gamle mennesker og gnavere viser en transskriptionsprofilen switch og reduceret regenerativ potentiale 16, 17, </sup> 18, 19. Satellitceller i muskler fra gamle mus og mennesker har også vist sig at undergå senescens resulterer i deres reducerede funktioner 20.
Den mest etableret cellelinie muliggør studiet af musklen homeostase er murine C2C12 cellelinje 21. En væsentlig del af undersøgelser har også brugt murine primære myoblaster 22. Disse kulturer har ført til en betydelig forståelse af murine og hvirveldyr myogenese samt muskel regenerering, myotube / myofiber atrofi, og hypertrofi processer, der forekommer i løbet af muskel sygdom og aldring 23, 24, 25, 26. For nylig har adskillige grupper beskrevet under anvendelse humane primære myoblaster at studere myogenese og muskel aldring. Men der er mangel på konsensus med Regards til forskelle mellem primære myoblaster isoleret fra musklen af voksne og ældre mennesker 27, 28, 29, 30, 31. Trods forskelle kendetegnet ved den systemiske og lokale miljø opstår under udvikling, aldring og sygdom 6, 32, 33, 34, in vitro myoblast og myotube kulturer forbliver de mest tilgængelige værktøjer til at studere molekylære mekanismer, der er forbundet med muskel udvikling, vækst og atrofi. Derudover disse undersøgelser tilvejebringer ikke kun et robust, men også en relativt hurtig, billig og høj kapacitet in vitro værktøj. Desuden etiske implikationer forbundet med studier af menneskelige muskler betyder, at for funktionelle forsøg med manipulationer af genekspression <em>, Forbliver i vitro menneskelige myoblast og myotube kulturer det eneste alternativ til rådighed for hvirveldyr modelorganismer.
Her viser vi en simpel forsøgsprotokol for robust, billig og reproducerbar isolering af primære myoblaster eller Middelhavspartnerlandene, fra musklen af voksne og ældre mennesker og beskrive standardiserede betingelser for in vitro-dyrkning (figur 1). Som primære kulturer fra muskel indeholder normalt fibroblaster foruden myoblaster, anbefaler vi en preplating skridt sigter mod forbedret renhed og kvalitet af primære myoblaster. For at opsummere, har vi etableret en protokol der giver mulighed for en effektiv og reproducerbar isolation, kultur og funktionelle studier af beriget og funktionelle Middelhavspartnerlandene / primære myoblaster fra skeletmuskulatur af voksne og ældre mennesker.
Her præsenterer vi en enkel, robust, billig, reproducerbar og effektiv metode til at isolere muskel stamceller / primære myoblaster fra voksne og ældre mennesker fra extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller bortføreren halluces muskler. Denne protokol er at tillade undersøgelser med humane primære myoblaster fra voksne og ældede mennesker, især når mere sofistikerede metoder, såsom FACS- eller MACS-sortering, er ikke er muligt eller praktisk.
Isoleringen metode præsenteres i dette håndskrift tager ca. 2 timer. Under muskel isolation, blev muskel vasket i 70% ethanol for at undgå forurening. Før enzymatisk dissociering af musklen, er det vigtigt at skære musklen i små men synlige stykker, og undgå celleskader fra for meget hakning. De fordøjelse resultater i dissociation af myofibre og frigivelse af satellit celler og myogene præcursorceller. I vores tilfælde for ~ 20 mg skeletmuskler, en 60 mm(20 cm2) petriskål var den mest passende overfladeareal til høst af cellerne. Celler udpladet på en større overflade udviste reduceret proliferation, hvorimod celler udpladet på en mindre overflade viste øget celledød og agglutinering.
Efter isolering, blev cellerne dyrket og ekspanderet på laminin-dækket plader. Anvendelsen af ikke-coatede overflader tendens til at falde succes isolation. Af denne grund kan celler fortrinsvis høstet på et forud belagt overflade direkte efter isolation. Fibroblaster-berigede kulturer vil dominere i stedet myoblaster-afledte celler, hvis cellerne høstes på et ikke-belagte overflade direkte efter isolation. Bortset fra laminin, kan anvendes brugen af andre cellevedhæftningsfaktorer løsninger såsom Matrigel og collagen-baserede reagenser. Coating løsninger kan omfatte vækstfaktorer og andre forbindelser, der vil fremme cellevækst, men disse kunne ændre cellens opførsel og derfor de eksperimentelle resultater. Ivores erfaring, 10 ug / ml laminin er den optimale koncentration og passende belægning reagens til satellit celler og myoblast vedhæftning og spredning, da det mangler enhver vækstfaktor eller andre komplementer. Desuden laminin er naturligt til stede i den basale lamina, direkte forbundet med sarcolemma, som spiller en central funktion i satellit cellebinding og migration gennem skeletmuskulatur fiber.
Tillæggene af kulturen medier kan også have en skadelig indflydelse på adfærden af den primære myoblast. For eksempel vækstfaktor grupper, såsom FGF'er eller IGF'er, har pleiotrope virkninger på primær myoblast kulturer, med FGF-2 styrer både mitogen og programmeret celledød svar 31. Det er derfor nødvendigt at strengt styre dyrkningsbetingelser, især fordi forskellene i adfærd primære myoblaster isoleret fra muskel af voksne og ældre mennesker er meget sandsynligt, at være på grund af renheden of kulturer og sandsynligheden for fibroblaster enden heraf myoblaster i kultur under langvarige kulturer 35. Vi har anvendt 1 time før udpladning af cellerne under den første opdeling på et ikke-belagte overflade for at mindske kontamineringen af kulturerne med fibroblaster.
Fremgangsmåden beskriver vi er hensigtsmæssig til isolering af myogene progenitorceller fra musklerne i både voksne og ældede mennesker. Den isolerede celle består af en repræsentativ myogene population af celler som indikeret ved en høj procentdel af myogene celler (MyoD ekspression og myogene egenskaber visualiseret ved MF20 immunofarvning i figur 1 og 2) og kan anvendes som en in vitro model for funktionelle studier af processer forbundet med muskel homeostase.
Tidligere undersøgelser har karakteriseret den isolation og forskelle i egenskaber, eller mangel på samme, af humane primære myoblaster fravoksen og ældre mennesker 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. Eksistensen af geriatriske og / eller ikke-funktionelle humane Middelhavspartnerlandene er påvist 6, 20, 22. Men ingen forskel i opførslen af frisk isolerede humane Middelhavspartnerlandene har også vist sig, 27. Vores protokol giver mulighed for isolering af primære myoblaster der i det mindste delvist bevarer deres fænotype, såsom reduceret proliferativ potentiale eller ældning af primære myoblaster isoleret fra muskel i ældre mennesker og tillader anvendelsen af disseceller til funktionelle studier af molekylære mekanismer muskel homeostase under aldring 22.
De primære myoblaster isoleret under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her, kan anvendes ikke kun til myogene differentierings- studier, men også for at undersøge intracellulære ændringer, såsom ændringer i genekspression forekommer i humane myogene precursorceller under ældning. Men har brug for, forandringer, der sker i celler under langvarig ex vivo kultur, der skal overvejes, når man analyserer fænotypiske og genotypiske forandringer under ældning. Vi anbefaler at bruge frisk isolerede celler til dette formål.
Desuden primære myoblaster kultur her beskrevne fremgangsmåde giver mulighed for ekspansion og relativt langvarig dyrkning af humane primære myoblaster, der giver mulighed for robuste in vitro funktionelle undersøgelser. Vi har tidligere vist, at myogene progenitorceller isoleret ved hjælp af vores fremgangsmåde kan anvendes til både ekspression profilering og functional studier af processer i forbindelse med muskel aldring 22. Denne metode kan også anvendes til musklerne i voksne og gamle gnavere og tillader isolering af en beriget kultur af myoblaster, der kan anvendes til profilering genetiske og epigenetiske ændringer under aldring og funktionelle studier 22. Begrænsningerne ved denne fremgangsmåde indbefatter anvendelsen af, til en vis grad, blandet population af celler frem for en ren population af satellitceller, der kan opnås ved anvendelse mere sofistikerede publicerede fremgangsmåder 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.
Vi præsenterer en forenklet, overkommelige og reproducerbar protokol til isolering af primære myoblaster celler fra voksne og ældremennesker. Det er vores erfaring, de tilgængelige, mere sofistikerede metoder til isolering og dyrkning af humane primære myoblaster (såsom MACS- eller FACS-sorteret satellit celler) er ideelle til nogle typer af undersøgelser, såsom profilering transkriptom eller proteomiske forandringer i cellerne. Disse fremgangsmåder er dyre, kræver i det mindste nogle niveau af ekspertise, og kan vise sig vanskelig på grund af den lave proliferative sats af rene primære myoblast kulturer og fibroblaster tilgroning myoblaster.
Vi præsenterer en reproducerbar protokol, der tillader enkel isolering og dyrkning af humane primære myoblaster til anvendelse i funktionelle studier. Derudover foreslår vi brug af laminin 42 og den begrænsede brug af bFGF som væsentlige faktorer for en vellykket kultur 44. Vi foreslår også at undgå stress genereret ved centrifugering, når opdele cellerne og en pre-plating skridt ad den første passage 45. For at opsummere, vi haroptimeret en effektiv protokol til isolering og dyrkning af primære myoblaster / Middelhavspartnerlandene fra musklerne i voksne og ældre mennesker, der også gælder for musklerne i gnavere og muliggør udtryk og funktionelle studier af muskel homeostase.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |