Detta protokoll beskriver en robust, reproducerbar och enkel metod för isolering och odling av myoblast progenitorceller från skelettmuskel av vuxna och äldre människor. De muskler som används här inkluderar fot- och benmusklerna. Detta tillvägagångssätt möjliggör isolering av en berikad population av primära myoblaster för funktionella studier.
Skelettmuskel homeostas beror på muskeltillväxten (hypertrofi), atrofi och förnyelse. Under åldrande och i flera sjukdomar, sker muskelförtvining. Förlust av muskelmassa och funktion är associerad med muskelfibertypen atrofi, fibertyp växling, defekt muskelregenerering associerad med dysfunktion av satellitceller, muskelceller stamceller och andra patofysiologiska processer. Dessa förändringar är förknippade med förändringar i intracellulära samt lokala och systemiska nischer. I tillägg till de vanligaste gnagarmodeller av muskel åldrande, finns det ett behov att studera muskel homeostas och slösa med användning av humana modeller, som på grund av etiska konsekvenser, består främst av in vitro-kulturer. Trots den utbredda användningen av mänskliga myogenic stamceller (MPC) och primär myoblaster i myogenes finns begränsade uppgifter om användning av humana primära myoblast och myotube kulturer för att studera molekylära mekanismer som reglerar olika aspekter av åldersrelaterad muskel slöseri, medhjälp i validering av mekanismer för åldrande föreslås i gnagare muskel. Användningen av mänskliga Medelhavsländerna, primära myoblaster och myotuber isolerade från vuxna och äldre människor, ger en fysiologiskt relevant modell av molekylära mekanismer av processer i samband med muskeltillväxt, atrofi och förnyelse. Här beskriver vi i detalj en robust, billig, reproducerbar och effektiv protokoll för isolering och underhåll av mänskliga Medelhavsländerna och deras avkomma – myoblaster och myotuber från humana muskelprover med hjälp av enzymatisk nedbrytning. Dessutom har vi fastställt antal passage där primära myoblaster från vuxna och äldre människor genomgår åldrande i en in vitro-kultur. Slutligen visar vi förmågan att transfektera dessa myoblaster och förmågan att karakterisera deras proliferativa och differentieringskapacitet och föreslå deras lämplighet för att utföra funktionella studier av molekylära mekanismer myogenes och muskelförtvining in vitro. </p>
Sjukdoms- och åldersrelaterad progressiv förlust av skelett muskelmassa och funktion resulterar i svaghet, minskad styrka och minskad livskvalitet äldre människor. Skelettmuskulatur svarar för cirka 40% body mass 1. Under åldrande och sjukdom, progressiv atrofi av individuella myofibers och nedsättning av muskel kvalitet på grund av infiltrationen av fett och fibros inträffar en, två, tre, fyra, fem, sex. Nyligen har det föreslagits att artspecifika skillnader i åldrande skelettmuskel inträffa, särskilt att muskelfiberförlust inträffar hos gnagare, inte kan förekomma i människor 7. Ändå är de återstående muskelfibrer av åldern däggdjur som kännetecknas av ökad känslighet för skador och nedsatt förnyelse <supclass = "xref"> 8. Vuxen muskel reparation och underhåll förmedlas av satellitceller 9, 10. Vid muskelskada och andra relevanta ledtrådar, satellitceller blir aktiverade och föröka sig. En undergrupp av cellerna återvänder till vilotillståndet och resten fortskrider in i myoblaster (Myogenic progenitorceller – MPCs). Dessa bidrar till reparation av den befintliga myofiber 11. Funktionaliteten av satellitceller avgör framgången av muskelregenerering och förändringarna i satellitcell tillgänglighet med åldrandet har visats 12, 13, 14, 15. Dessutom satellitceller från muskel hos gamla människor och gnagare visar en transkriptionell profil switch och reducerad regenerativ potential 16, 17, </sup> 18, 19. Satellitceller av muskel från gamla möss och människor har också visat att genomgå åldrande resulterar i sin reducerad funktionalitet 20.
Den mest etablerad cellinje som möjliggör studier av muskel homeostas är murina C2C12 cellinje 21. En betydande del av studier har också använt murina primära myoblaster 22. Dessa kulturer har lett till en betydande förståelse för mus och ryggradsdjur myogenes liksom muskelregenerering, myotube / myofiber atrofi, och hypertrofi processer som sker under muskelsjukdom och åldrande 23, 24, 25, 26. På senare tid har flera grupper som beskrivs med hjälp av humana primära myoblaster att studera myogenes och muskel åldrande. Men det är brist på samförstånd med regards till skillnader mellan primära myoblaster isolerade från muskeln av vuxna och åldrade människor 27, 28, 29, 30, 31. Trots skillnader som kännetecknas i den systemiska och lokala miljön inträffar under utveckling, åldrande och sjukdom 6, 32, 33, 34, i myoblast och myotube vitro kulturer fortfarande de mest tillgängliga verktyg för att studera molekylära mekanismer i samband med muskel utveckling, tillväxt och atrofi. Dessutom dessa studier ger inte bara en robust, men också en relativt snabbt, billigt och med hög genomströmning in vitro verktyg. Dessutom etiska konsekvenser i samband med studier av mänskliga muskler innebär att för funktionella försök med manipulationer av genuttryck <em>, In vitro humana myoblast och myotube kulturer förblir det enda alternativet tillgängligt för ryggradsdjur modellorganismer.
Här visar vi en enkel försöksprotokoll för robust, billig och reproducerbar isolering av primära myoblaster, eller MPC, från muskeln av vuxna och äldre människor och beskriva standardiserade villkor för odling in vitro (Figur 1). Som primära kulturer från muskler innehåller vanligtvis fibroblaster förutom myoblaster, rekommenderar vi en preplating steg som syftar till förbättrad renhet och kvalitet på primär myoblaster. Sammanfattningsvis har vi etablerat ett protokoll som möjliggör effektiv och reproducerbar isolering, kultur och funktionella studier av berikade och funktionella Medelhavsländerna / primära myoblaster från skelettmuskel av vuxna och äldre människor.
Här presenterar vi en enkel, robust, billig, reproducerbar och effektiv metod för att isolera muskel progenitorceller / primära myoblaster från vuxna och äldre människor från extensor digitorium brevis, tibialis anterior eller kidnappare halluces muskler. Detta protokoll syftar till att möjliggöra studier med hjälp av humana primära myoblaster från vuxna och äldre människor, särskilt när mer sofistikerade metoder, såsom FACS- eller MACS sortering, är inte är möjligt eller praktiskt.
Metoden isolering som presenteras i detta manuskript tar ungefär 2 timmar. Under muskel isolering, var muskeln tvättas i 70% etanol för att undvika kontaminering. Före enzymatisk dissociation av muskeln, är det viktigt att skära muskeln i små men synliga bitar, och undvika cellskador från för mycket malning. De matsmältningen resulterar i dissociation av myofibers och frisläppandet av satellitceller och myogena prekursorceller. I vårt fall för ~ 20 mg skelettmuskulaturen, en 60 mm(20 cm 2) Petri-skål var det lämpligaste ytarea för skörd av cellerna. Celler ströks ut på en större yta uppvisade minskad proliferering, medan celler ströks ut på en mindre yta visade ökad celldöd och agglutination.
Vid isolering, cellerna odlades och expanderat på laminin-täckta plattor. Användning av icke-belagda ytor tenderade att minska framgången av isolering. Av denna anledning, kan celler företrädesvis skördades på en i förväg belagd yta direkt efter isolering. Fibroblaster-berikade kulturer kommer att dominera i stället för myoblaster-härledda celler om cellerna skördas på en icke-belagd yta direkt efter isolering. Bortsett från laminin, kan användas vid användning av andra cellvidhäftnings lösningar såsom Matrigel och kollagenbaserade reagens. Beläggningslösningar kan inkludera tillväxtfaktorer och andra föreningar som kommer att främja celltillväxt, men dessa skulle kunna ändra cellbeteende och därför de experimentella resultaten. IVår erfarenhet är 10 mikrogram / ml laminin den optimala koncentrationen och lämplig beläggning reagens för satellitceller och myoblast fastsättning och spridning eftersom det saknar tillväxtfaktor eller andra komplement. Dessutom är laminin naturligt förekommer i den basala lamina, direkt kopplad till sarcolemma, som spelar en nyckelfunktion i satellitcellvidhäftning och migration genom skelettmuskulaturen fiber.
De tillskott av odlingsmedia kan också ha en skadlig inverkan på beteendet hos den primära myoblast. Till exempel tillväxtfaktor grupper, såsom FGF eller IGF, har pleiotropa effekter på primär myoblast kulturer, med FGF-2 styra både mitogen och programmerad celldöd svar 31. Det är därför nödvändigt att noggrant kontrollera odlingsbetingelserna, i synnerhet på grund av skillnader i beteendet hos primär myoblaster isolerade från muskler av vuxna och äldre människor är mycket sannolikt att bero på renheten of kulturerna och sannolikheten för fibroblaster överskridande de myoblaster i odling under långa kulturer 35. Vi har använt en-timmars för-plätering av cellerna under den första klyvningen på en icke-belagd yta i syfte att minska kontaminering av kulturerna med fibroblaster.
Den metod vi beskriver är lämpliga för att isolera myogenic stamceller från musklerna i både vuxna och äldre människor. Den isolerade cellen består av en representativ myogenic population av celler såsom indikeras av en hög procentandel av myogena celler (MyoD expression och myogena egenskaper kan visualiseras med MF20 immunofärgning i fig 1 och 2) och kan användas som en modell för funktionella studier av processer in vitro i samband med muskel homeostas.
Tidigare studier har präglat isolering och skillnader i egenskaper, eller brist på sådan, av humana primära myoblaster frånvuxna och äldre människor 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 6, 37, 38. Förekomsten av geriatriska och / eller icke-funktionell human MPCs har visats 6, 20, 22. Däremot har ingen skillnad i beteendet hos nyligen isolerade mänskliga partnerländerna också visats 27. Våra protokoll möjliggör för isolering av primära myoblaster som åtminstone delvis bibehåller sin fenotyp, såsom minskad proliferativ potential eller åldrandet av primär myoblaster isolerade från muskler av äldre människor och tillåter användning av dessaceller för funktionella studier av molekylära mekanismer för muskel homeostas under åldrande 22.
De primära myoblaster isolerade med hjälp av den metod som beskrivs här kan användas inte bara för myogena differentieringsstudier utan också att undersöka intracellulära förändringar, såsom förändringar i genuttryck som förekommer i humana myogena prekursorceller under åldrandet. Men förändringar som sker i celler under förlängd ex vivo kultur måste beaktas när man analyserar fenotypiska och genotypiska förändringar som sker under åldrandet. Vi rekommenderar att du använder nyisolerade celler för detta ändamål.
Dessutom den primära myoblast odlingsmetoden som beskrivs här medger expansion och relativt långvarig odling av humana primära myoblaster, vilket möjliggör robusta funktionella studier in vitro. Vi har tidigare visat att myogenic stamceller som isolerats med hjälp av vår metod kan användas för både uttrycksprofilering och functional studier av processer i samband med muskel åldrande 22. Denna metod är också tillämplig på musklerna i vuxna och gamla gnagare och möjliggör isolering av en berikad kultur av myoblaster som kan användas för profilering genetiska och epigenetiska förändringar under åldrande och funktionella studier 22. Begränsningarna med denna metod innefattar användningen av, i viss utsträckning, blandad population av celler snarare än en ren population av satellitceller, som kan erhållas genom att använda mer sofistikerade publicerade metoder 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42, 43.
Vi presenterar en förenklad, prisvärda och reproducerbar protokoll för isolering av primära myoblaster celler från vuxna och äldremänniskor. I vår erfarenhet, tillgängliga, mer sofistikerade metoder för isolering och odling av humana primära myoblaster (t.ex. MACS- eller FACS-sorterade satellitceller) är idealiska för vissa typer av undersökningar, såsom profilering transcriptomic eller proteomik förändringar i cellerna. Men dessa metoder är dyra, kräver minst en viss nivå av kompetens, och kan visa sig vara svår på grund av den låga proliferativa hastigheten för rena primära myoblast kulturer och fibroblaster igenväxande myoblaster.
Vi presenterar en reproducerbar protokoll som möjliggör enkel isolering och odling av humana primära myoblaster för användning i funktionella studier. Dessutom föreslår vi användning av laminin 42 och den begränsade användningen av bFGF som nyckelfaktorer för en framgångsrik kultur 44. Vi föreslår också att undvika den stress som genereras genom centrifugering vid delning av cellerna och en pre-plating steg i den första passagen 45. För att summera, har vioptimerat ett effektivt protokoll för isolering och odling av primära myoblaster / MPCs från musklerna i vuxna och åldrade människor som också är tillämplig på musklerna i gnagare och möjliggör uttryck och funktionella studier av muskel homeostas.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |