이 연구의 목표는 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포에서 성공적인 유전자 변환에 대 한 허용 하는 기술을 공식화 했다. 인간의 lentiviral 변환 dextran 중재 또는 더 높은 유전자 식 효율성에 마우스 기본 NK 세포 결과. 이 방법은 유전자 변환의 NK 세포 유전자 조작을 향상 방대 하 게 됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
자연적인 살인자 (NK) 세포에 특정 유전자의 효율적인 변환 주요 도전 하고있다. 성공적인 transductions는 개발, 차별화, 및 NK 세포의 기능에 관심사의 유전자의 역할을 정의 하는 데 중요 합니다. 암 immunotherapy에 공상 항 원 수용 체 (자동차)에 관련 된 최근의 진보 effector 세포에 세 유전자를 전달 하는 효율적인 방법에 대 한 필요성을 강조 합니다. 기본 인간 또는 마우스 NK 세포 중재 lentiviral 유전자 transductions의 효율성 유지 크게 낮은 주요 제한 요인입니다. 최근 진보 양이온 중합체, polybrene, 등을 사용 하 여 T 세포에서 향상 된 유전자 변환 효율을 표시 합니다. 그러나, 이러한 제품 NK 셀의 변환 효율을 개선 하지 못했습니다. 이 작품 보여줍니다 그 dextran, 분기 글 루 칸 다 당 류, 크게는 인간의 변환 효율 및 마우스 기본 NK 세포 향상 됩니다. 이 높은 재현성 변환 방법론 인간의 기본 NK 세포, 임상 유전자 배달 응용 프로그램 및 따라서 NK 세포 기반 암 immunotherapy. 훨씬 향상 시킬 수 있는 시험을 위한 유능한 도구를 제공 합니다.
서론
자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 시스템1의 주요 림프모구 인구. NK 세포는 종양과 감염2,,34에 대 한 호스트 면역 반응의 첫 번째 라인 수비수로 작동합니다. NK 세포는 또한 발산5와 강력한 cytokines의 분 비를 통해 관용의 개발에 중심 역할을 한다. 종양 세포를 대상으로 그들의 강력한 능력으로 인해 여러 임상 시험 암6,7에 대 한 입양 immunotherapy로 인간 NK 세포 기증자 파생 된을 평가 하기 위해 실시 되고있다. 달리 T 세포, NK 세포의 발달 생물학이 있다 아직 잘 특징8. 지식의이 부족은 부분적으로 마우스 또는 인간의 기본 NK 세포의 유전자를 전달 하는 효율적인 기술의 부재 때문입니다. 이러한 이유로 대부분의 NK 세포 연구 1 차 셀 대신 셀 라인에서 실시 되었습니다. 따라서, 안정적이 고 효율적인 프로토콜 transduce 기본 NK 세포의 ....
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프로토콜
모든 동물 프로토콜 동물의 자비 롭 고 윤리적인 치료를 따 랐 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 내는 생물 의학 연구 센터 (BRC) 의학 대학 위스콘신 (MCW), 밀워키, 위스콘신에 의해 승인 했다. 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 혈액 센터 위스콘신, 밀워키, 위스콘신의 혈액 연구소의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었다.
1. 마우스, 셀 라인, 및 벡터
- 상용 공급 업체에서 C57BL/6 마우스를 가져옵니다. 병원 체-무료 조건에서 마우스 식민지를 유지 하 고 6과 12 주 사이의 암컷과 수 컷 쥐를 사용 하 여. IRB 승인 소스에서 취소 확인 된 인간의 PBMCs를 가져옵니다.
- Anesthetize는 마우스를 프로필 렌 글리콜 (1, 2-propanediol, USP 급료)에 20-30 %v / v isoflurane의 혼합물으로 동물 anesthetize 쥐 마 취하는 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.
- 동물 안락사, 마 취 유도 후 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
- 단단히 쥐고 한 손으로 꼬리의 기지에 의해 쥐를 제 지. 튼튼한 스틱 형 펜 또는 엄지와 첫 번째 손가락, 목의 뒤에 대....
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결과
Dextran 유도 lentiviral 벡터 기본 인간과 murine NK 세포에서의 효율적인 유전자 이동
인간 NK 세포 격리 및 (85% 이상의 순도)와 PBMC에서 정화 되었고 rIL-2 300 U/mL와 함께 밤새 껏 알을 품. 이러한 기본 NK 세포 감염의 다양 한 복합성에 GFP lentivirus로 불리고 다음 했다 (나; 3, 10, 및 셀 20 IU) 8 µ g/mL Pb, PS, 또는 dextran 있을 때 24-잘 접시에. 셀 60 분 1000 × g에서 centrifuged 그리고 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 (바이러스)의 존재. 셀 씻어 고 7 일에 대 한 rIL-2 300 U/mL와 함께 신선한 RPMI1640 완전 한 매체에서 resuspended. 변환 효율 cytometry GFP 식 변환 후 7 일.......
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토론
이 연구는 양이온 폴리머 에이전트 murine 및 인간의 기본 NK 세포의 lentiviral 변환 효율 향상 dextran의 사용 하는 보여줍니다. 또한, 다른 양이온 대리인, Pb 등 PS, 아무 인지할 수에 영향을 바이러스 성 벡터의 기본 인간 NK 세포에. 이전에, Pb 인간 T 세포17에 유전자 변환 증가 수 있습니다 입증 되었습니다. 그러나 이러한 결과, Pb도 PS 기본 인간 NK 세포에 비슷한 효율을가지고 제안. 이 연구에서 Pb만 겸손 하 게 변환 효능 향상 murine NK 세포에서. 그것은 보였다는 증강으로 BX795, TBK1/IKKɛ, 및 PS의 억제제를 사용 하 여 세포내 항 바이러스 방어 메커니즘의 저해 lentiviral 변환 효율25증가 시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 결과 보여주었다이 억제제는 murine 인간의 기본 NK 세포 (데이터 표시 되지 않음)에 변환 효능에 영향을 주지 않습니다.
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공개 사항
금융 분쟁의 관심을 주장 하는 저자.
감사의 글
우리는 루시아 Sammarco와 그녀의 룰 루의 레모네이드 스탠드 영감, 동기 부여, 및 지원을 위한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 AI102893와 NCI R01 CA179363 (S.M.);에 의해 부분적으로 지원 NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); 알렉스 레모네이드 스탠드 재단 (S.M.); MACC 기금 (S.M.;의 HRHM 프로그램 S.R.; M.S.T); 니콜라스 가족 재단 (S.M.); Gardetto 가족 (S.M.); 현대 학자 (M.S.T.) 프로그램; 바퀴 (S.R.);에 현대 희망 MACC 기금 (M.S.T. 및 S.M.); 어린이 연구소, MCW (S.R.); 그리고 캐시 Duffey Fogerty 수상 (M.J.R.).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 덱스트란 | 시그마-알드리치 | 90-64-91-9 | |
| 폴리브레네(Pb) | 시그마-알드리치 | TR-1003 | |
| 프로타민 설페이트(PS) | 시그마-알드리치 | p3369 | |
| 트립신 | 코닝 | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | 코닝 | 10-040-CV | |
| 소 태아 혈청 | 아탈란타 | S11150 | |
| 페니실린 | 코닝 | 30-001-CI | |
| B-메르캅토에탄올 | SIGMA | M3148 | |
| 피루브산 | 나트륨 코닝 | MT25000CI | |
| 인터페론 감마 (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding 염색 용액 | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| 마우스 | Jakson | 664 | |
| 293T 세포 | ATCC, | CRL-3216 | |
| T75 플라스크, | Cornnig | 430641U | |
| 항체 기반 음성 선택 키트, | 줄기 세포 | 19055 | |
| 51Chromium (Cr) 방출 분석 | perkin elmer의 | NEZ030 | |
| ELISA 키트 | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| 부티르산나트륨 | 시그마 | 5887-5G | |
| 선형 폴리에틸렌이민 | 폴리사이언스 | 23966-2 | |
| Ficoll | GE 생명과학 | 17-1440-03 | |
| HBSS | 코닝 | 21-022-CV |
참고문헌
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (....
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