This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Denne detaljerede protokol skitserer gennemførelsen af billedet-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning til fremstilling af vaskulære-afledte mikrofluide netværk indlejret i PEGDA hydrogeler. Her beskriver vi skabelsen af virtuelle masker, der giver mulighed for billedet-guidet laser kontrol; fotopolymerisation af en micromolded PEGDA hydrogel, egnet til mikrofluid netværk fabrikation og trykhøjde-drevet flow; opsætning og brug af et kommercielt tilgængeligt laser konfokalt parret med en femtosekund pulserende Ti: S laser til at fremkalde hydrogel nedbrydning; og billeddannelse af jern- mikrofluide netværk under anvendelse af fluorescerende arter og konfokal mikroskopi. Meget af protokollen er fokuseret på den korrekte opsætning og implementering af makro mikroskop software og mikroskop, da disse er afgørende skridt på anvendelse af et kommercielt mikroskop for mikrofluide fabrikation formål, der indeholder en række snørklede. Billedet-styrede del af denne technique muliggør gennemførelsen af 3D billedstakke eller brugergenererede 3D-modeller, og dermed giver mulighed for kreativ mikrofluid design og til fremstilling af komplekse mikrofluide systemer af næsten enhver konfiguration. Med en forventet effekt i tissue engineering, kunne metoderne i denne protokol støtte i fremstilling af avancerede biomimetiske microtissue konstruktioner for organisationer og menneskelige-on-a-chip-enheder. Ved at efterligne komplekse arkitektur, snoning, størrelse og tæthed af in vivo vaskulatur, kan fundamentale biologiske transportprocesser gentages i disse konstruktioner, hvilket fører til mere nøjagtig in vitro modellering af farmakokinetik og sygdom.
Det vaskulære system, der består af både lymfe og cardiovasculature, formularer meget tætte netværk, som er nødvendige for transport af næringsstoffer og ilt og til fjernelse af metaboliske affald. Derfor celler bosat i vaskulariserede væv er aldrig over 50-100 um væk fra et fartøj 1. Evnen til at reproducere in vivo vaskulær arkitektur in vitro er kritisk for nøjagtigt modellere in vivo transportprocesser ved hjælp manipulerede konstruktioner. Med en nylig drev til at udvikle orgel-on-a-chip indretninger 2 til high-throughput lægemiddel-screening 3,4 og sygdom modellering 5,6, fremgangsmåder skabe mikrofluide netværk, rekapitule- in vivo-lignende transport i syntetiske eller naturlige hydrogeler er tegning betydelig interesse. For at forbedre biomimetik af microtissues anvendes i disse enheder, udviklede vi et billede-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning metode, der udnytter tre-dimensionell (3D) billede stakke af indfødte kar som skabeloner til at generere vaskulære-afledte mikrofluide netværk indlejret i PEGDA hydrogeler 7. Denne protokol beskriver brugen af en kommercielt tilgængelig laser-konfokalt udstyret med en femtosekund pulserende laser til at fabrikere vaskulære-afledte, biomimetiske mikrofluide netværk i PEGDA hydrogeler via billede-styret, laserbaseret nedbrydning.
Aktuelle tilgange til fluidisering hydrogeler omfatter induktion af vaskulogen 8-10 eller angiogene 10-12 endotelceller selv-montage og microfabrication teknikker til at skabe foruddefinerede kanaler endothelialisering 13-16. Mens selvsamlede net rekapitulere tætheden og kompleks arkitektur Mikrovaskular, er de ofte mere permeable end in vivo net 11,17,18, som kan være problematisk i modellering transport til lægemiddelscreening applikationer. Self-samlet netværk består af physiologtisk relevant, kapillære mellemstore fartøjer, men de kan være svære at integrere med bulk-fluidstrøm grund af begrænsninger i at generere større arteriole-sized fartøjer. Da der ikke er nogen direkte kontrol over samlingen af disse netværk, kan den endelige arkitektur variere fra prøve til prøve, hvilket gør det vanskeligt at gentagne gange producerer netværk med de samme fluid flow og transport egenskaber.
For at generere 3D, hydrogel-indlejret mikrofluide netværk med gentagelig geometri og veldefineret arkitektur, har en række microfabrication teknikker blevet udviklet, herunder modulær montering 13, 3D-print af offer materialer 16, direkte-write montage 14, og rundstrålende udskrivning 15. Anvendelse af disse metoder, mikrofluid arkitektur, og derfor fluid flow og transport egenskaber, kan gentagne gange fremstilles på tværs af mange konstruktioner. En væsentlig begrænsning af disse fremgangsmåder, er imidlertid den manglende evne til at skabe microfluidic netværk med kapillar-store funktioner, 4 til 10 um 19. De fleste microfabrication teknikker er ofte begrænset til funktioner i området fra 150 til 650 um i diameter 13,16. Nogle eksisterende teknikker er i stand til at generere hierarkiske netværk med kanaler over et område bred diameter, 10 til 300 um til direkte-write enhed 14, og 18 til 600 um for omnidirektionel udskrivning 15, men de er begrænset i deres evne til at frembringe tætte netværk eller til at producere flere mikrofluide netværk i nærheden inden for en enkelt konstruktion 7.
For at overvinde nogle af disse begrænsninger, vi udviklede et billede-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning teknik, der giver gentagelig fremstilling af biomimetiske, hierarkiske mikrofluide netværk, rekapitulere arkitektur in vivo mikrovaskulatur. For at gøre dette, en 790 nm, 140 femtosekund (fs) pulserende laser arbejder ved 80 MHz er raster-scannet in ønsket 3D steder i en hydrogel, som defineret af billeder af in vivo-kar. Vi spekulere, at nedbrydningsprocessen fungerer via laser-induceret optisk opdeling af vand, det resulterende plasma formationen, efterfølgende hurtig termoelastisk udvidelse af vand, og den lokale nedbrydning af hydrogelen som vandet ekspanderer 20. Denne mekanisme varierer lidt fra laser-baserede nedbrydning af protein-baserede hydrogeler 21-24. I modsætning PEGDA, som har en lav multifoton tværsnit, proteiner har ofte et stort multifoton tværsnit og derfor nedbrydes via en multifoton absorption-induceret kemisk brud 23. For at generere billedbaserede guidet mikrofluide netværk, er laser lukker styres af billedbaserede afledt virtuelle masker, som består af en mosaik af områder af interesse 9, der definerer mikrofluid arkitektur. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi demonstreret evne til at fremstille 3D vaskulær-afledte biomimetiske mikrofluidic netværk, som rekapitulere tætte og snoede arkitektur in vivo vaskulatur, for at lokalt styre porøsiteten af hydrogeler ved at ændre mængden af energi, der leveres under nedbrydning. Vi har også været i stand til at generere to uafhængige mikrofluide net, intertwine i umiddelbar nærhed (15 pm), men aldrig direkte forbinder 7. Vi har også demonstreret evne til at endothelialize laser-nedbrudt mikrokanaler ved post nedbrydning funktionalisering med integrin ligering peptidsekvens, Arginin-glycin-asparaginsyre-serin (RGDS), for at fremme endotelcelleadhæsion og lumen dannelse 7.
Med denne protokol, er generering af komplekse mikrofluide netværk i PEGDA hydrogeler muliggjort via billede-styret, laser-baserede nedbrydning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt mikroskop tilgængelig på mange universiteter. Som nedbrydningsprocessen er styret af digitale, virtuelle masker, denne fabrication teknik er modtagelig for kreative design af mikrofluide netværk, hvilket tillader dets anvendelse i en lang række anvendelser. Vi forventer, at den her beskrevne fremgangsmåde vil være mest fordelagtig i design biomimetiske organisationer og menneskelige-on-a-chip indretninger stand til at replikere biologiske transportprocesser vigtige i modellering lægemiddeltransport 2. Denne fabrikation teknik kan også være af interesse til generering af in vitro sygdomsmodeller, herunder kræft metastase 5,6 og blod-hjerne-barrieren modeller 25. Som laserbaseret hydrogel nedbrydning tidligere er blevet brugt til at skabe spor for vejledning af neuronal udvækst 21-23, kunne billedet-guided udvidelse af denne teknik vise sig nyttig i avancerede vævsmanipuleringsindretninger strategier til position celler i brugerdefinerede 3D rumlige arrangementer.
Kritisk i tvingende standard funktioner i mikroskop software til at muliggøre brugen af virtuelle masker til billedet-styret, laserbaseret nedbrydning, skal mikroskop makro sættes op og manipuleres omhyggeligt. Hvordan mikroskop software grænseflader med mikroskop makro kan undertiden være ulogisk, og blev investeret mange kræfter i at bestemme de optimale indstillinger i begge programmer til at udvikle denne metode. En generel forståelse af grundlæggende laser-konfokalt brug anbefales, især med "Trin" og "Focus" vinduer til at finde og korrekt placere hydrogel i x, y og z dimensioner, før du prøver laserbaseret nedbrydning. Derudover fremstillingen af en indgang kanal er afgørende for den protokol; suspenderede fluorescerende arter skal kunne indtaste mikrofluide systemer for en vellykket billedbehandling og netværk karakterisering. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol gælder for en bestemt laser-konfokalt konfigureret med en specifik femtosekund pulserende laser, der kører bestemte versioner af mikroskop software og mikroskop makro (se detaljer i Liste over specifikke materialer / udstyr). Vi har opdaget, at nyere versioner af mikroskopet makro mangler den nødvendige kontrol og funktionalitet er nødvendig for billedet-styret laser kontrol. Selv om der kan benyttes andre mikroskop platforme og pulserende laser kilder, denne protokol gælder specifikt til dette system og skal ændring i henhold til den platform, laser kilde, og software implementeret. De grundlæggende principper i hele denne protokol gælder stadig, dog.
En potentiel ændring til denne protokol indebærer ændre hydrogel sammensætning. Her udnyttede vi 5 vægt%, 3,4 kDa PEGDA hydrogeler, men laserbaseret nedbrydning (til formål, bortset fra mikrofluid netværk generation) er blevet gennemført for at nedbryde både syntetiske og naturlige hydrogeler, herunder PEGyleret fibrinogen 21,22, silke protein hydrogeler 23, og kollagen 24. Justering af lasereffekten, scanningshastighed, afstand mellem Z-skiver, og antallet af gentagelser vil hjælpe med at afgøre de optimale parametre for at fabrikere mikrofluide netværk i andre hydrogelformuleringer.
En strømbegrænsning af teknikken er den samlede mængde af hydrogel, der kan nedbrydes i en gennemførlig mængde tid. For at skabe åbne hulrum eller mikrofluide funktioner i hydrogel, laseren dvæle tid skal være på eller over 8,96 mikrosekunder / pixel (eller en laser scanning hastighed på 0,021 um / uS) ved brug af en laser fluens på 37,7 nJ / um 2. Med disse indstillinger, det tager 1,4 timer til at nedbryde fartøjer inden for en 0,014 mm 3 volumen (som set i figur 1). Ved hjælp af en laser opholdstid på 4,48 mikrosekunder / pixel eller derunder, leverede energi er ikke nok for fuld nedbrydning af hydrogel formulering, der anvendes her. Implementering af en anden hydrogelSammensætningen kunne overvinde denne begrænsning. Brugen af fotolabile geler, der indeholder lysfølsomme komponenter 34-36 eller hydrogeler, der har store multifoton tværsnit 21-24 er gode muligheder, der ville gøre det muligt at anvende mindre energi og ville resultere i hurtigere nedbrydning. Med hensyn til dimensionelle begrænsninger, har funktioner blevet fremstillet op til 1,5 mm dybt i hydrogelen 7. Dybden opnåelige er en funktion af arbejdsmiljøet afstand af målet, og kan forøges ved brug ultra-lange mål arbejdstid distance optimeret til in vivo billeddannelse. Den mindste målte kanal 7 skabt ved hjælp af en 20X (NA1.0) nedsænkning i vand mål havde en bredde på 3,3 m og dybde på 8,9 um, hvilket er på niveau med størrelsen af de mindste kanaler genereret i figur 1. Mens andre laboratorier har brugt mindre NA mål 21,23,24, forventer vi, at mikrofluide netværk med mindre funktioner kan genereres ved hjælp af højER NA mål på bekostning af en reduceret arbejdsafstand. Men i sidste ende opløsningen af teknikken er en funktion af punktspredningsfunktion af den fokuserede laserstråle, idet laserscanningen egenskaber, mængden af energi, der leveres af laseren, og laseren absorptionsegenskaber af materialet nedbrydes.
Endvidere laser egenskaber (hastighed, fluens, afstand mellem virtuelle masker, og antallet af gentagelser) skal optimeres baseret på hydrogel egenskaber (tværbindingsdensitet, makromer / monomer molekylvægt vægtprocent, og typen af hydrogel: protein-baserede vs. syntetisk ), da disse i sig selv vil ændre interaktioner med laseren og dermed den endelige beslutning af processen. Som den energi der leveres også er påvirket af det mål, der anvendes, er yderligere optimering kræves, når du skifter mellem mål. Med hensyn til omkostningerne, er adgang til et mikroskop med en pulserende laser påkrævet, og mens mange forskellige målsættiver kan anvendes, dem med en høj NA og lang arbejdsafstand (til in vivo billeddannelse) kan være dyre.
Ud over protokollen beskrevet her, kan mikrofluide netværk dannet ved anvendelse af denne teknik også være funktionaliseret med celle-klæbende peptider post-kanal fabrikation at inducere endotelcelleadhæsion og lumen dannelse 7. Derudover kunne inkorporeringen af celle-nedbrydeligt peptidsekvenser i bulkmaterialet 9 før kanalisere nedbrydning muliggøre studiet af cellemigrering ind i og gennem hydrogelen. Til kontinuerlig fluidisering af mikrofluid netværk indenfor hydrogel, kan hydrogeler fotopolymeriseres i større fluide enheder eller huse, som vist i figur 2 og 3 7.
Frembringelsen af vaskulære netværk via vaskulogen eller angiogene selvsamling 8-12 giver en enkel tilgang til at fremkalde vascularization hele en relativt stor hydrogel volumen. Mens denne fremgangsmåde resulterer i perfusable fluide net er det vanskeligt direkte styre størrelsen, snoning, tæthed og samlet netværksarkitektur. På grund af denne begrænsning, kan strømmen profil og forskydningshastigheder i vaskulaturen varierer mellem eksperimenter. Alternativt microfabrication teknikker 13-16 muliggør direkte kontrol over netværksarkitektur men er ofte begrænset af deres manglende evne til at generere små, kapillære størrelse kanaler eller fremstillingen af tætte netværk, der efterligner in vivo vaskulær arkitektur. Mens laser-baserede hydrogel nedbrydning teknik skitseret her er for nylig blevet repurposed for mikrofluid generation, den samtidig overvinder både den arkitektoniske kontrol og størrelse-baserede begrænsninger eksisterende microfabrication metoder ved at muliggøre skabelsen af 3D biomimetiske mikrofluide netværk, rekapitulere tæthed, snoning, størrelsesorden, og samlede architecture af in vivo kar. Endvidere kan flere fluide netværk genereres i samme hydrogel, hvilket tillader undersøgelse af inter-net transport 7. For vævsdyrkningsapplikationer der stræber efter at tættere replikere in vivo transportprocesser i vitro, de meget løst hydrogeldannende indlejret mikrofluide netværk beskrives her, er velegnede. Vi forventer, at denne protokol vil være nyttigt i at udvikle væv konstruktioner, som mere præcist efterligne in vivo transport til brug som narkotika screening udstyr og in vitro sygdomsmodeller.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |