कोरोनरी की तरह शर्तों के तहत इन विट्रो में Astrocyte जेट और प्रसार की निगरानी
Summary
कोरोनरी स्ट्रोक एक जटिल घटना है जिसमें ऑक्सीजन ग्लूकोज़ अभाव (OGD) के संपर्क में आने वाले प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्र में astrocytes का विशिष्ट योगदान अध्ययन करने के लिए मुश्किल है । यह लेख अलग astrocytes प्राप्त करने के लिए एक पद्धति का परिचय और OGD शर्तों के तहत उनके जेट और प्रसार का अध्ययन ।
Abstract
कोरोनरी स्ट्रोक एक जटिल मस्तिष्क चोट मस्तिष्क के कुछ हिस्सों के लिए एक थक्का या थक्का बाधा रक्त प्रवाह की वजह से है । इससे ऑक्सीजन और ग्लूकोज का अभाव होता है, जो ऊर्जा की विफलता और न्यूरॉन की मौत का कारण बनता है । एक कोरोनरी स्ट्रोक अपमान के बाद, astrocytes प्रतिक्रियाशील हो जाते हैं और चोट साइट के आसपास पैदा के रूप में यह विकसित करता है । इस परिदृश्य के तहत, यह मुश्किल है के लिए astrocytes के विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने के लिए दिमाग के ischemia को उजागर क्षेत्र । इसलिए, इस अनुच्छेद के एक पद्धति का परिचय एक इन विट्रो मॉडल के तहत प्राथमिक astrocyte जेट और प्रसार का अध्ययन करने के लिए पर्यावरण की तरह, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव (OGD) कहा जाता है । Astrocytes 1-4 दिन पुराने नवजात चूहों से अलग थे और गैर विशिष्ट astrocytic कोशिकाओं की संख्या astrocyte चयनात्मक मार्कर Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और परमाणु धुंधला का उपयोग का आकलन किया गया था । अवधि जिसमें astrocytes OGD हालत के अधीन है अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ ऑक्सीजन का प्रतिशत वे करने के लिए उजागर कर रहे हैं । यह लचीलापन वैज्ञानिकों को इन विट्रो मेंकोशिकाओं के विभिन्न समूहों में कोरोनरी की तरह हालत की अवधि को चिह्नित करने की अनुमति देता है । यह आलेख चर्चा करता है कि OGD की समय सीमा astrocyte जेट, hypertrophic आकृति विज्ञान और प्रसार के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मापा Proliferating सेल परमाणु Antigen (PCNA) का उपयोग कर । प्रसार के अलावा, astrocytes ऊर्जा और oxidative तनाव से गुजरना, और कोशिका माध्यम में घुलनशील कारकों को रिहा करके OGD का जवाब । इस माध्यम एकत्र किया जा सकता है और कोशिका के लिए सेल संपर्क के बिना प्राथमिक ंयूरॉंस संस्कृतियों में astrocytes द्वारा जारी अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया । संक्षेप में, इस प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल कुशलता से चोट पर अलग astrocytes की भूमिका को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
स्ट्रोक “संवहनी मूल के एक तीव्र स्नायविक रोग के रूप में या तो अचानक या लक्षण और संकेत के तेजी से विकास के साथ परिभाषित किया गया है, मस्तिष्क में फोकल क्षेत्रों की भागीदारी के लिए इसी”1,2. वहाँ स्ट्रोक के दो प्रकार के होते हैं: रक्तस्रावी और कोरोनरी. जब नाड़ी रोग या तो एक धमनीविस्फार या एक paco खराबी, एक धमनी के पीछे टूटना के साथ कमजोर के साथ के कारण होता है, इस रक्तस्रावी स्ट्रोक3 जो, ज्यादातर मामलों में, मौत की ओर जाता है । जब एक थक्का या एक थक्का पहुंचा रक्त प्रवाह, ऑक्सीजन और एक मस्तिष्क क्षेत्र में ग्लूकोज की एक अस्थाई अभाव के कारण, यह कोरोनरी स्ट्रोक4कहा जाता है । प्रभावित क्षेत्र या कोरोनरी कोर के आसपास कोशिकाओं को पोषण देने में विफलता एक समस्थिति और चयापचय असंतुलन, ऊर्जावान रोग, ंयूरॉन मौत, और सूजन5है, जो रोगियों के लिए एक जीवन भर विकलांगता पैदा कर सकते है की ओर जाता है6।
कोरोनरी स्ट्रोक एक multifactorial चोट कोशिकाओं के कई प्रकार है कि प्रतिक्रिया और अलग समय बिंदुओं पर उनके प्रभाव डालती शामिल है । कई इंटरैक्शन व्यक्तिगत कक्षों के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक कठिन वातावरण बनाते हैं. तो, कैसे हम इस तरह के एक जटिल वातावरण के तहत एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के योगदान का अध्ययन करते हैं? एक स्वीकार किए जाते है इन विट्रो में ischemia के मॉडल के लिए ऑक्सीजन और ग्लूकोज (OGD) अभाव कोशिकाओं को उजागर करने के होते हैं, एक निश्चित अवधि के लिए, एक normoxic वातावरण के लिए कोशिकाओं की बहाली के बाद । इस प्रणाली के रक्त reperfusion द्वारा पीछा एक कोरोनरी स्ट्रोक simulates । इस विधि में, कोशिकाओं या ऊतकों एक ग्लूकोज के लिए एक वातावरण में मुक्त मीडिया को उजागर कर रहे हैं ऑक्सीजन की पर्ज, एक विशेष hypoxic चैंबर का उपयोग. OGD मशीन समय कुछ मिनट से 24 घंटे तक भिंन हो सकते हैं, परिकल्पना है कि परीक्षण किया जाना चाहता है पर निरभर है । अध्ययनों से पता चला है कि OGD और normoxic पर्यावरण के समय के आधार पर, स्ट्रोक के विशिष्ट phenotypes (यानी, तीव्र या जीर्ण) प्राप्त किया जा सकता है । प्राथमिक पृथक astrocytes, normoxic शर्तों को पीछे बहाली के साथ OGD को उजागर, एक अच्छी तरह से अध्ययन किया सेलुलर मॉडल है इन विट्रो7मेंस्ट्रोक की नकल करने के लिए । OGD का प्रयोग एक स्ट्रोक की तरह पर्यावरण के तहत अलग कोशिकाओं के स्वतंत्र आणविक तंत्र प्रकट संभव है ।
astrocyte जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान बढ़ जाती है के रूप में, यह स्पष्ट है कि वे synapses बनाए रखने और तंत्रिका की मरंमत, विकास, और प्लास्टिक8बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । सामांय परिस्थितियों के तहत, astrocytes रिलीज और साइटोकिंस, chemokines, वृद्धि कारकों और gliotransmitters, homeostasis5,9के भीतर चयापचय संतुलन और synapses रखने के लिए जवाब । एक्यूट neuroinflammation में, जैसे कि कोरोनरी स्ट्रोक, इन कोशिकाओं को प्रतिक्रियाशील बन सकता है, Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) की एक लंबी अवधि के व्यक्ती दिखाने के लिए, और उनकी आकृति विज्ञान5,10में अतिवृद्धि दिखाने के लिए, 11 , 12. के रूप में कोरोनरी infarct विकसित करता है, astrocytes द्वारा प्रदान की homeostasis प्रभावित हो जाता है, सामांय ग्लूटामेट अधिक से अधिक, ऊर्जा चयापचय, सक्रिय अणुओं के आदान प्रदान के बारे में, और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि13।
infarct ऊतक के आसपास पुनः सक्रिय astrocytes पैदा जबकि ल्यूकोसाइट्स घावों वाले क्षेत्र की ओर पलायन करते हैं14. Astrocytic जखीरे को proliferating सेल न्यूक्लियर antigen (PCNA), Ki67, और bromodeoxyuridine (BrdU)15जैसे मार्करों का उपयोग करके मापा जा सकता है । इस प्रफलन प्रतिक्रिया एक समय पर निर्भर तरीके से उत्पन्न होता है और यह glial निशान, एक चोट के बाद क्षतिग्रस्त साइट के पैरेन्काइमा के साथ अचल प्रतिक्रियाशील astrocytes की एक सरणी के गठन में मदद करता है9. इस निशान के प्रारंभिक कार्यों में से एक इस क्षेत्र से प्रतिरक्षा कोशिका extravasation सीमा है । हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि निशान axons के लिए एक भौतिक बाधा को बढ़ाने के लिए हो जाता है, के रूप में वे axonal विकास में बाधा अणुओं जारी है, और एक शारीरिक घायल क्षेत्र के आसपास के विस्तार से axons को रोकने बाधा पैदा16। फिर भी, वहां वैज्ञानिक दिखा रहा है कि एक रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद पूरी तरह से रोकने glial निशान गठन axons17के उत्थान ख़राब कर सकते है सबूत है । इस प्रकार, संदर्भ जिसमें विशिष्ट astrocytic प्रतिक्रिया मापा जाता है, पर विचार किया जाना चाहिए चोट के ढांचे का अध्ययन ।
प्रस्तुत पद्धति को astrocytes के व्यक्तिगत समारोह का अध्ययन करने के बाद ऑक्सीजन ग्लूकोज के अभाव में लागू किया जा सकता है और यह सवाल है कि जांचकर्ता जवाब चाहता है के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, रूपात्मक परिवर्तन और मार्करों अलग OGD बार में व्यक्त के अलावा, OGD को उजागर astrocytes से supernatants आगे घुलनशील इन कोशिकाओं द्वारा जारी कारकों की पहचान करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, या एक वातानुकूलित मीडिया के रूप में इस्तेमाल के लिए इसका आकलन अंय मस्तिष्क कोशिकाओं में प्रभाव । इस दृष्टिकोण astrocyte जेट कि कारकों है कि शासन और एक कोरोनरी स्ट्रोक परिदृश्य में उनकी प्रतिक्रिया मिलाना के elucidation के लिए नेतृत्व कर सकता है पर अध्ययन सक्षम बनाता है ।
Protocol
प्रसव चूहों (Sprague Dawley) 1-4 दिन पुराने cortices को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । इच्छामृत्यु की विधि decapitation है, जैसा कि NIH दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित है ।
1. सर्जरी के लिए उपकरणों और सामग्री की तै?…
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल चूहे cortices से astrocytes के अलगाव का वर्णन करता है । इस विधि में, यह microglia, oligodendrocytes, और fibroblasts जैसे अंय सेलुलर प्रकार के साथ संदूषण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । microglia की संख्या को कम करने के लिए, कई कदम उठाए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक तकनीकी सहायता के लिए Paola López Pieraldi का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । A.H.M. इस प्रकाशन का समर्थन करने वाले पलाश 8G12MD007600 और U54-NS083924 के लिए आभारी है । सुविधा सहायता के लिए हम NIH-NIMHD-G12-MD007583 अनुदान का धन्यवाद करते हैं । D.E.R.A. NIHNIGMS-R25GM110513 द्वारा प्रदान की फैलोशिप के लिए आभारी है । हम आम कर्मशाला क्षेत्र के उपयोग और RCMI कार्यक्रम की ऑप्टिकल इमेजिंग सुविधा के उपयोग के लिए अनुदान G12MD007583 द्वारा डॉ Priscila Sanabria की सहायता के लिए आभारी हैं. इसके अलावा, हम फिल्म और संपादन दृश्य प्रोटोकॉल में उनकी उत्कृष्ट भूमिका के लिए जोस ेके शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
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