قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما<em> في فيفو</em> نماذج التنموية لدراسة مجمع خلية الى خلية اشارة شبكة التفاعلات

Summary

تفاصيل هذه المقالة الفيديو مباشرة في منهجية الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لمنهجية وكفاءة تميز مكونات مسارات الإشارات المعقدة وشبكات تنظيمية في العديد من الأجنة اللافقاريات.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

شبكات الجينات التنظيمية (GRNs) وإشارة مسارات نقل تنشئ التعبير المكاني والزماني للجينات خلال التطور الجنيني التي تستخدم لبناء خطة الكبار جسم الحيوان. خلية الى خلية مسارات نقل الإشارة هي المكونات الأساسية لهذه الشبكات التنظيمية، وتوفير الوسائل التي تتواصل الخلايا. هذه التفاعلات الخلوية إنشاء وصقل التعبير عن الجينات التنظيمية والتمايز في ومن بين المناطق المختلفة خلال مرحلة التطور الجنيني ^{1 و 2.} التفاعلات بين جهري يفرز خارج الخلية (بروابط، الخصوم)، المستقبلات، وشارك في مستقبلات السيطرة على أنشطة مسارات نقل الإشارة. مجموعة متنوعة من الجزيئات داخل الخلايا transduces هذه المدخلات مما أدى إلى التعبير المعدلة وراثيا، وتقسيم، و / أو شكل الخلية. في حين أن العديد من الجزيئات الأساسية المستخدمة على الصعيدين خارج الخلية والخلايا في مسارات رئيسية هيالمعروف، وهو المعرفة غير مكتملة بسبب في جزء كبير منه إلى تعقيد مسارات الإشارات الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، مسارات الإشارات المختلفة غالبا ما تتفاعل مع بعضها البعض إما سلبا أو إيجابا في الخلية، داخل الخلايا، ومستويات النسخي ^{3، 4، 5، 6.} الأهم من ذلك أن المكونات الأساسية لمسارات نقل الإشارة والحفظ جدا في جميع الأنواع metazoan، وبشكل ملحوظ، فإن معظم مسارات الإشارات الرئيسية غالبا ما تؤدي وظائف تنموية مماثلة في العديد من الأنواع عند المقارنة بين الكائنات الحية من من الكائنات الحية ذات صلة وثيقة على وجه الخصوص ^{7، 8، 9، 10، 11.}

دراسة يشير خلال التنمية هي مهمة شاقة في أي كائن حي، وهناكهي عدة تحديات كبيرة لدراسة مسارات إشارات في معظم النماذج ثنائي الفم (الفقاريات، حبليات اللافقارية، نصف حبليات، وشوكيات الجلد): 1) في الفقاريات هناك أعداد كبيرة من الممكن يجند والتفاعلات مستقبلات / المشارك المغير، جزيئات تنبيغ الخلايا، وكذلك التفاعلات المحتملة بين مسارات الإشارات المختلفة نظرا لتعقيد للجينوم ^{12، 13، 14؛} 2) مورفولوجيا معقدة والحركات التخلق في الفقاريات غالبا ما تجعل الأمر أكثر صعوبة لتفسير التفاعلات الوظيفية في وبين مسارات نقل الإشارة. 3) تحليل في معظم الأنواع اللافقارية نموذج ثنائي الفم غير شوكي-تقتصر من قبل ويندوز قصيرة من الحمول باستثناء بعض الأنواع الغلالة ^{15 و 16.}

القنفذ البحر الجنين لديها عدد قليل من القيود المذكورة أعلاه ويقدم العديد من المزايا الفريدة لإجراء تحليل مفصل لمسارات نقل الإشارة في الجسم الحي. وتتضمن ما يلي: 1) البساطة النسبية للجينوم قنفذ البحر يقلل بشكل ملحوظ من عدد ممكن يجند، مستقبلات / مستقبل مساعد والخلايا جزيء التنبيغ التفاعلات ^17؛ 2) GRNs السيطرة على مواصفات والزخرفة من طبقات جرثومية ومحاور الجنينية الرئيسية هي راسخة في الأجنة قنفذ البحر، والمساعدة في فهم السياق التنظيمي للخلية / إقليم تلقي الإشارات ^{18، 19؛} 3) العديد من مسارات نقل إشارة يمكن دراستها بين مراحل الانقسام والمعيدة في وقت مبكر عندما تتكون الأجنة من ظهارة الطبقات واحدة التي التشكل هو أسهل لتحليل. 4) جزيئات تنطويد في مسارات إشارات في والتلاعب بها بسهولة قنافذ البحر. 5) وحامل العديد من قنافذ البحر لمدة 10 إلى 11 شهرا في السنة (على سبيل المثال Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus).

هنا، فإننا نقدم وسيلة لتمييز منهجي وكفاءة مكونات مسارات الإشارات التي تحدد والأقاليم نمط في الأجنة قنفذ البحر لتوضيح المزايا التي توفرها العديد من الأنظمة نموذج اللافقارية في دراسة الآليات الجزيئية المعقدة.

Protocol

1. استراتيجية تصميم Morpholino إنتاجية عالية تحديد الجين (ق) من الفائدة (على سبيل المثال نهج الجين مرشح، تحليل رابطة الدول المستقلة التنظيمية، RNAseq و / أو شاشات التفاضلية البروتين). استخدام ال?…

Representative Results

في جنين قنفذ البحر أظهرنا أن 3 إشارات Wnt مختلف فروع (WNT / β-كاتينين، WNT / JNK، وWNT / بي كي سي) 4، 25 تفاعل لتشكيل شبكة الإشارات WNT الذي يحكم الأمامي الخلفي (ا ف ب) الزخرفة. إحدى النتائج الأكثر أهمية في هذه الأحداث يشير هو أن أعرب ع…

Discussion

منهجية المعروضة هنا هي مثال يوضح قوة باستخدام الأجنة مع أقل التعقيد الجيني والصرفي من الفقاريات لفهم مسارات الإشارات تنبيغ وGRNs التي تحكم آليات التنموية الأساسية .. العديد من المعامل تستخدم المقايسات مماثلة خلال تطوير قنفذ البحر في وقت مبكر لتشريح مسارات الإشارات ال…

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G