כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em> ב Vivo</em> מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

Summary

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

ג'ין רשתות רגולטוריות (GRNs) ואת מסלולי העברת אותות להקים הביטוי במרחב ובזמן של גנים במהלך ההתפתחות העוברית המשמשים לבניית תוכנית גוף החיה הבוגרת. תא אל תא מסלולי העברת אותות הם מרכיבים חיוניים של רשתות רגולטוריות אלו, מתן הכלי שבאמצעותו תאים מתקשרים. אינטראקציות הסלולר אלה להקים ולשפר את הביטוי של גני רגולטוריים והבחינו ובקרב בשטחים השונים במהלך embryogenesis ^{1, 2.} אינטראקציות בין מאפננים תאיים מופרשים (הליגנדים, אנטגוניסטים), קולטנים, ו-קולטנים שיתוף לשלוט על פעילות מסלולי העברת אותות. מבחר של מולקולות תאיות transduces תשומות אלה וכתוצאה מכך ביטוי גנים שהשתנה, חלוקה, ו / או צורה של תא. בעוד רבים של מולקולות המפתח בשימוש ברמות התאיות ו תאי על המסלולים העיקריים הםידוע, הוא ידע שלם נובע במידה רבה למורכבות של מסלולי איתות בודדים. בנוסף, מסלולי איתות שונים לעתים קרובות אינטראקציה זה עם זה חיובי או שלילי על התאים, תאיים, ורמות תעתיק ^{3, 4, 5, 6.} חשוב לציין, מרכיבי הליבה של מסלולי העברת אותות הם שמורים ביותר בכל המינים מטזואניים, ו, להפליא, רוב מסלולי איתות הגדולים לעתים קרובות לבצע פונקציות התפתחותי דומות במינים רבים כאשר משווים אורגניזמים טווח מערכת קשור קשר הדוק בפרט ^{7, 8, 9, 10, 11.}

המחקר של איתות במהלך ההתפתחות הוא משימה מרתיעה בכל אורגניזם, וישכמה אתגרים משמעותיים ללימוד מסלולי איתות במודלים השניוניים הפה ביותר (בעלי חוליות, המיתרנים חסרי חוליות, hemichordates, ו echinoderms): 1) בקרב בעלי חוליות יש מספר גדול של ליגנד האפשרי ואינטראקציות קולטן / אפנן-שיתוף, מולקולות התמרה תאיות, כמו גם אינטראקציות פוטנציאליות בין נתיבים שונים מאותתים בשל המורכבות של הגנום ^{12, 13, 14;} 2) המורפולוגיה המורכבת ותנועות המוךפו"גנטי שהולכות חוליות לעתים קרובות לעשות את זה יותר קשה לפרש אינטראקציות תפקודיות ובקרב מסלולי העברת אותות; 3) ניתוח ברוב מיני מודל שאינו קווצי עור חסר חוליות שניוניות פה מוגבל על ידי חלון קצר gravidity למעט כמה מיני מיתרני זנב ^{15, 16.}

העובר ים קיפוד יש כמה מן המגבלות הנ"ל ומציע איכויות ייחודיות רבות לביצוע ניתוח מפורט של מסלולי העברת אותות in vivo. אלה כוללים את הבאים: 1) הפשטות היחסית של הגנום קיפוד הים מפחית באופן משמעותי את המספר ליגנד אפשרי, קולטן / שיתוף הקולטן מולקולת התמרה תאית קשרי גומלין ^17; 2) GRNs שליטה במפרט הדפוסים של השכבות הניבטות וגרזנים עובריים עיקריים מבוססות היטב בעוברי קיפוד ים, בסיוע להבנת ההקשר רגולטוריות של התא / טריטורית קבלת האותות ^{18, 19;} 3) מסלולי העברת אותות רבים ניתן ללמוד בין שלבי מחשוף gastrula מוקדם כאשר עוברים מורכבת של האפיתל שכבתית יחידה מורפולוגיה אשר קל יותר לנתח; 4) המולקולות לערבד ב מסלולי איתות של קיפודי הים הם מניפולציה בקלות; 5) קיפודי ים רבים המעוברים במשך 10 עד 11 חודשים בשנה (למשל Strongylocentrotus purpuratus ו Lytechinus variegatus).

כאן, אנו מציגים שיטה בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות המציינים וטריטוריות דפוס בעוברי קיפוד ים כדי להמחיש את היתרונות כי מספר מערכות מודל חסרות חוליות להציע בחקר מנגנונים מולקולריים מורכבים.

Protocol

1. עיצוב אסטרטגית Morpholino תפוקה גבוהה לזהות גן (ים) של עניין (גישת הגן המועמד למשל, ניתוח הרגולציה ציס, RNA-seq ו / או מסכי ההפרש proteomic). השתמש גנומית, transcriptomic, ונתוני ביטוי גנים באתרים מתעדכנים ב…

Representative Results

בעובר הים קיפוד הראינו כי 3 איתות סניפים Wnt שונים (Wnt / β-קטנין, Wnt / JNK, ו Wnt / PKC) 4, 25 פועלים יחד כדי ליצור רשת איתות Wnt השולט הקדמי-אחורי דפוסים (AP). אחת התוצאות החשובות ביותר של אירועי איתות אלה היא כי קדמי neuroectoderm רחב הביע הר?…

Discussion

המתודולוגיה המוצגת כאן היא דוגמא שממחישה את הכח של שימוש בעוברים עם מורכבות גנומית וצורניות פחות חוליות להבין את מסלולי העברת איתות GRNs המסדירים מנגנוני התפתחותיים יסוד .. מעבדות רבות משתמשות מבחנים דומים במהלך התפתחות קיפוד הים מוקדם לנתח את מסלולי איתות מעורבים בא…

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G