Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em> In Vivo</em> Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Summary

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In – vivo – Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

Gene regulatorische Netzwerke (KNS) und Signaltransduktionswege schaffen die räumliche und zeitliche Expression von Genen während der embryonalen Entwicklung, die verwendet werden, um die erwachsenen tierischen Körper Plan zu bauen. Zell-Zell-Signalwege sind wesentliche Bestandteile dieser regulatorischen Netzwerke, die Bereitstellung der Mittel, durch die Zellen in Verbindung stehen. Diese zellulären Interaktionen etablieren und die Expression von regulatorischen und Differenzierung Gene in und zwischen den verschiedenen Gebieten während der Embryonalentwicklung ^{1, 2} zu verfeinern. Wechselwirkungen zwischen sezerniert extrazellulären Modulatoren (Liganden, Antagonisten), Rezeptoren und Co-Rezeptoren steuern die Aktivitäten von Signaltransduktionswegen. Eine Auswahl von intrazellulären Molekülen wandelt diese Eingänge in veränderter Genexpression, Abteilung führt, und / oder die Form einer Zelle. Während viele der Schlüsselmoleküle bei den extrazellulären und intrazellulären Spiegel in den Hauptwegen verwendet werden,bekannt ist, ist es eine unvollständige Kenntnis der Komplexität der einzelnen Signalwege zu einem großen Teil. Zusätzlich interagieren verschiedene Signalwege oft miteinander entweder positiv oder negativ auf den extrazellulären, intrazellulären und Transkriptionsebenen ^{3, 4, 5, 6.} Wichtig ist , dass die Kernkomponenten von Signaltransduktionswegen hoch in allen metazoan Spezies konserviert, und bemerkenswert, führen die meisten der wichtigsten Signalwege oft ähnliche Entwicklungsfunktionen in vielen Arten , wenn Organismen von eng verwandten Stämmen insbesondere ^{7, 8, 9} zu ^{vergleichen, 10, 11.}

Die Studie der während der Entwicklung Signalgebung ist eine schwierige Aufgabe in jedem Organismus, undmehrere bedeutende Herausforderungen zu studieren Signalwege in den meisten Deuterostomia Modelle (Vertebraten, Invertebraten Chordaten , Kiemenlochtiere und Echinoderme): 1) In Vertebraten gibt es eine große Anzahl von möglichen Liganden und Rezeptor / Co-Modulator – Wechselwirkungen, die intrazelluläre Transduktion Moleküle sowie mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Signalwegen aufgrund der Komplexität des Genoms ^{12, 13, 14;} 2) Die komplexe Morphologie und morphogenetische Bewegungen bei Wirbeltieren oft erschweren funktionelle Interaktionen in und unter Signaltransduktionswege zu interpretieren; 3) Die Analysen in den meisten Nicht-echinoderm invertebrate Deuterostomia Modellarten werden durch kurze Fenster von gravidity mit Ausnahme einiger tunicate Arten ^{15, 16} begrenzt.

DasSeeigel embryo hat einige der oben erwähnten Beschränkungen und bietet viele einzigartige Eigenschaften für eine detaillierte Analyse von Signaltransduktionswegen in vivo durchgeführt wird . Dazu gehören die folgenden: 1) Die relative Einfachheit des Genoms Seeigel reduziert signifikant die Anzahl der möglichen Ligand, Rezeptor / Co-Rezeptor und intrazellulären Transduktion Molekül – Wechselwirkungen ^17; 2) Die KNS die Spezifikation und die Strukturierung der Keimblätter und die wichtigsten embryonalen Achsen steuern gut in Seeigel – Embryonen etabliert, in dem Verständnis der regulatorischen Kontext der Zelle / Gebiet Beihilfe Empfangen der Signale ^{18, 19;} 3) Viele Signaltransduktionswege können zwischen frühen Spaltung und Gastrula Stadien untersucht werden , wenn Embryonen von einem einschichtigen Epithel , deren Morphologie bestehen ist einfacher zu analysieren; 4) Die Moleküle beinhaltend in Bahnen in den Seeigeln Signalisierung leicht manipuliert werden; 5) Viele Seeigel sind für 10 bis 11 Monate im Jahr (zB Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus trächtig).

Hier präsentieren wir eine Methode, um systematisch und effizient Komponenten der Signalwege zu charakterisieren, die angeben, und das Muster Gebiete in Seeigel-Embryonen, die Vorteile zu verdeutlichen, dass mehrere wirbellosen Modellsysteme in der Studie von komplexen molekularen Mechanismen bieten.

Protocol

1. Hoher Durchsatz Morpholino Design Strategy Identifizieren eines Gens (e) von Interesse (zB Kandidatengen – Ansatz, cis-regulatorische Analyse, RNA-Seq und / oder Proteom – Differential – Bildschirme). Verwenden Sie genomischen, Transkriptom und Genexpressionsdaten auf häufig aktualisierte Webseiten (zB SpBase http://www.echinobase.org 20 und S. purpuratus Genom suchen http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html), um festzustellen, dass der R…

Representative Results

Im Seeigel Embryo wir haben gezeigt , dass drei verschiedene Wnt – Signalzweige (Wnt / β-Catenin, Wnt / JNK und Wnt / PKC) 4, 25 interact ein Wnt – Signalnetzwerk zu bilden , die von vorne nach hinten (AP) Strukturierung regelt. Eine der wichtigsten Folgen dieser Signalisierungsereignisse besteht darin , dass die anfängliche breit ausgedrückt anterioren Neuroektoderm (ANE) GRN auf ein kleines Gebiet um den vorderen Pol durch d…

Discussion

Die Methodik präsentiert hier ist ein Beispiel, das die Macht der Verwendung von Embryonen mit weniger genomischen und morphologische Komplexität als Wirbeltiere zeigt die Signalübertragungswege und KNS Regierungs grundlegenden Entwicklungsmechanismen .. Viele Labors verwenden ähnliche Tests während der frühen Seeigel Entwicklung zu verstehen, die zu sezieren Signalisierung in anderen Zellschicksal Spezifikation Ereignisse beteiligt Wege (zB Notch, Igel, TGF – β und FGF – Signalisierung) <sup class="xref…

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G