פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.
גידול, התפתחות כלי הגידול, כמו גם גידול בתגובה הרפוי, הם תהליכים ביולוגיים דינמי מאוד. היסטולוגיה מספק מידע סטטי, לעתים קרובות לא מספיקה פרשנות נכונה. הערכה intravital, שבו תהליך מלווה בזמן, מספק מידע נוסף ובלתי צפוי לעתים קרובות. עם הקמתה של חיות הטרנסגניים לבטא סמנים ייחודיים תא, המשדרים תא חי, שיפורים ציוד הדמיה, הפיתוח של מספר תאי הדמיה, מיקרוסקופ intravital הפך כלי חשוב כדי להבין טוב יותר תהליכים ביולוגיים. מאמר זה מתאר עיצוב ניסיוני עבור החקירה של התפתחות כלי הגידול ואת ההשפעות הטיפוליות בצורה מרחבית טמפורלית. באמצעות תוכנית התקנה זו, בשלב של התפתחות כלי, תא עצה היווצרות לומן, זרימת הדם, extravasation, הוקמה המיטה כלי דם והרס כלי דם יכול להיות דמיינו ועקבתי. יתר על כן, השפעות טיפוליות intratumoral הגורל, הלוקליזציה של תרכובות כימותרפיות יכול גם להיות במעקב.
בעוד מחקרים במבחנה לאפשר דימות ברזולוציה קינטי של תהליכים, ניסויים במבחנה אינו מאפשר הערכה בהקשר הנכון. למשל, לא ניתן לחקור את האינטראקציה של תאים סרטניים עם תאי סטרומה או סמים משלוחים והפצה בתוך הגידול בצלחת תרבות. מודלים בעלי חיים משמשים ולכן כדי לחקות את הפיזיולוגיה האנושית ואת הפתולוגיה. עם זאת, ההדמיה האורך של תהליכים, במיוחד ברזולוציה subcellular, הוא מאתגר. שיטות הדמיה מולקולרית, כגון דימות תהודה מגנטית (MRI), פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיה (SPECT), ויש טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), חדירה לעומק אבל חוסר רזולוציה או להיכשל להמחיש מבנים אנטומיים. הדמיה אופטית מספק רזולוציה גבוהה ומאפשר ההדמיה של מבנים, אך מלווה עני חדירה מינימאלית1. היישום של מיקרוסקופ intravital בשילוב עם חלון קאמרית טכנולוגיות כגון הגבי skinfold או חלון בטן, מאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה ויוו2,3,4. טכנולוגיה זו יש יתרונות ברורים, שכן היא מאפשרת עבור הדמיה האורך במשך שעות, אפילו ימים, הדמיה של תהליכים בהקשר המתאים (למשל, אינטראקציות תאים תאים בתוך הרקמה שבעורך), ולכל הרזולוציות בקצה אופטי מיקרוסקופ קונפוקלי ו multiphoton מתקדם.
המבוא של חיות הטרנסגניים עם תוויות פלורסנט ספציפיים התא או חלבון פותחת שפע של אפשרויות experimentations ויוו ו- ex-vivo . עבור מופע, תא-תא אינטראקציות, ייצור חלבונים, וגם התגובה מניפולציה או טיפול שניתן ללמוד ויוו באמצעות אלה מודלים5,–6,–7,–8. חשוב למקם בתוך הזמן והמקום יכול להיקבע עם ציוד הדמיה מתאים, מתודולוגיה. כאן, את מיקרוסקופ intravital של חיות לבטא סמן אנדותל בשילוב עם סוכנים גידול מושתלים ששונה בזריקות הגבי skinfold קאמרית חלון מוצג.
כמו גידול, התפתחות כלי הגידול, כמו גם השפעות טיפוליות הגידול, הם תהליכים דינאמיים מאוד, הערכה intravital היא כלי אלגנטי לבצע הערכה נכונה של תהליכים אלה באופן זמן המרחבי ותלוי. עם הזמינות הגוברת של תא חי סמני היצירה של בעלי חיים מהונדס, קידום שיטות הדמיה, הדמיה intravital נהיה יותר ויותר פופולרי. למרות היסטולוגיה משמש עדיין באופן שגרתי, שפע של סמנים יכול לשמש כדי לזהות תאים ומבנים, רקמות חלוקתה יש חסרונות בחקירת תהליכים דינאמיים. חיתוך רקמה נדרשת, מתן מידע סטטי בלבד; קיבוע משפיעה על איכות רקמת; לחתוך נזקים באינטראקציה תאית. גם, כאשר חוקר תהליכים דינאמיים, רקמות לנתיחה בנקודות שונות, וכן לעיתים קרובות המשוער, זמן-דורש כמות גדולה של בעלי חיים. עם הדמיה intravital, ניתן להעריך את ממדי מרחבי XYZ ואת המימד הנוסף של הזמן של אותה חיה, שהופך את מיקום מתאים של שחקנים שונים אפשריים במרחב ובזמן. לכן, הן נקודות זמן אופטימלי ולא החמיצה, מספר בעלי חיים המשמש לכל ניסוי פוחת באופן משמעותי. שנית, חלון הזמן הקים עם הערכה intravital יכול להיות אומדן כדי למטב את רקמת החילוץ. שלישית, השלב הרצוי של גידול כלי יכול להיות מזוהה intravitally, צבעונית כמו רקמה כולה-הר.
העיצוב intravital הזכיר כתב יד זה משתמש בשילוב של חיות הטרנסגניים לבטא תווית פלורסנט בתאי האנדותל, ששונה הגבי skinfold קאמרית דגם מיקרוסקופ קונפוקלי-multiphoton ייעודי.
תאי אנדותל לעבור מספר שלבים21,22 במהלך אנגיוגנזה, שלבים אלה לעתים קרובות ניתן לראות בו זמנית גידול. באמצעות שורת העכבר eNOSTag-GFP, תאי אנדותל בודדים ניתן בעקבות, אפילו filopodia dynamics שיכול להוביל. לכן מודל טוב ללמוד התפתחות כלי intravitally. בהתאם לתוויות מהותי כבר-נוכח, סוכנים פלורסנט להזרקה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות לומן, זרימת הדם, extravasation, סיווג דם. העכבר הוא עם תמונה באופן רציף במשך עד 5 שעות. הערכת לטווח ארוך חיים הוא ריאלי כאשר נלקחים מספר אמצעי זהירות לגבי ההרדמה של החיה, אשר כבר שתוארה לעיל23. מחקר זה הוא מרוכז על סרטן, גידולים רקמות או תאים שהיו מושתלים. עם זאת, אנחנו גם ניסויים מתוך הרגל והריאות עובריים. עם זאת, קצב גדילת רקמה שנבחנה מגבילה, כאשר לאחר מספר שבועות, העור יתחיל לצמוח מחדש, שיכולה להיות בעיה עם גידולים או רקמות הגדלים לאט.
במהלך שלב אימות, מהראש skinfold חלון החדר היה שונה במידה ניכרת לעומת דגם קלאסי4. המסגרות נבנות מחומר סינתטי autoclavable והם קלים וקטנים, עם אזור נוף חלון גדול. הקרס של הטבעת הסגירה (דמות 1Bg, ראש חץ לבן) משמש רק עבור הסרת קל של הטבעת. שכר טרחה טבעות ללא ווים יכול לשמש כאשר אלה להפריע הדמיה. העור לא נמתחת מדי, התרופפות אינה מתרחשת במודל זה, של זיהומים הם רק לעתים נדירות. לבצע שינויים אלה לצמצם את אי נוחות בעלי חיים ולמקד את שגרת חיים באופן משמעותי. בנוסף, חלקי המתכת ניתן להסיר בקלות כאשר הדימות הגידול באמצעות MRI24.
כל מיקרוסקופ ניתן לאמץ intravitally התמונה הגבי צ’יימברס skinfold. הדרישה המרכזית היא השטח הפנוי בין השלב מיקרוסקופ העדשה אובייקטיבי. היבט חשוב המשפיעה על הדמיה היא תנועה. כדי למנוע תנועה חפצים, פלטפורמה מתאימה שבטבלה מיקרוסקופ (לאחר הסרת כל מוסיף) ותומך העכבר אמור לשמש. . זה לא הכרחי לרסן את העכבר כאשר זה תחת הרדמה, עדיף לתת את הנשימה העכבר בחופשיות. עם זאת, החלון. הוא נעול על הפלטפורמה, מתן קיבעון אופטימלית של שדה הראייה (קרי, הגידול הוא גלוי דרך חלון החדר). פלטפורמת מחוממת באמצעות רכיב pad חימום אלקטרוניות, משמש להסקה בעלי חיים. פלטפורמה זו נעשתה ללא צורך במיקור חוץ, פרטים ניתן לקבל על פי בקשה. עדשה המטרה ברזולוציה גבוהה היא הכרח בעת הערכת תהליכים תאיים והופכת אותו ניתן להפלות בין הציטופלסמה לגרעין. השימוש של עדשה מחודדות עם רזולוציה אופטית טובה (NA גבוהה) אבל ארוך יחסית ומרחק עבודה (רצוי 2 מ מ ומעלה) מומלץ. המגבלה בתחום ההדמיה היא עומק חדירה לבין עוצמת פלורסנט התוויות. יתר על כן, photobleaching, phototoxicity, רוויה יש להימנע במהלך דימות.
כאן, שימשו משולב קונאפוקלית-multiphoton ומיקרוסקופ קונפוקלי. Multiphoton הוא זקוף, אמנם קונאפוקלית מיקרוסקופ הפוכה. היתרון של מיקרוסקופ זקוף הוא השימוש קל של מים-טבילה עדשות. העדשות של נה גבוהה ויש הרבה זמן ומרחק עבודה, אפילו בהגדלה גדולה גבוהה (למשל, 20 או 40 X). באופן ספציפי, מומלץ להשיג 20 X 1.0 נה עדשה טבילה במים, אשר נמכרת על ידי מספר חברות. שים לב כי, כאשר משתמשים טבילה עדשות, המטרה העדשה ואת נוזל טבילה צריך להיות מחומם ל- 37 מעלות צלזיוס. עבור התמונות הטובות ביותר, מומלץ להשתמש בהגדרות קונאפוקלית אופטימלית (קרי, חריר-1 יחידה אוורירי, לייזר כוח נמוך כמו רווח אפשרי, לא יותר מדי גבוה (במיוחד אם הרווח מציג רעש), קו מהירות מקסימלית, וכן אין חישוב ממוצע של סריקות). חשיפת יתר, רוויה, הפרש עוצמות בין תמונות לסכן את איכות הנתונים. מומלץ למנוע הרוויה של חשיפת יתר. זה יכול להיות מצויין רכישת תמונות בהגדרות שונות רווח. שינוי של הרווח הוא הדרך הקלה ביותר כדי לשנות את הבהירות של התמונה. במידת הצורך, ניתן לכוונן את עוצמת הלייזר. כדי לתקנן את איכות התמונה, שקופיות עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית קבוע יכול לשמש. אחד יש לזכור כי גם כאשר המיקרוסקופ מוגדר בצורה אופטימלית, איכות התמונה נקבעת במידה רבה על-ידי האיכות של חלון תא, רקמה
בעת סריקה מספר סמני פלורסנט בו זמנית, בליד-דרך, שבה fluorophore אחד מתגלה הערוץ של עוד אחד, יש להמנע ממנו. הימנע בליד-דרך באמצעות שילוב של fluorophores עם ספקטרה חופפים מינימלי, רציפים סריקה בין מסגרות. התמונות שהוצגו כאן נסרקו באמצעות 3 סריקות רציפות (לעקוב אחרי 1: ה-GFP, DID או fluor647 עם לייזר 488, 633; רצועה 2: rhodamine, ודוקסיל או mTomato עם לייזר 543; ולעקוב אחר 3: Hoechst עם לייזר 405).
האפשרות של הערכת מספר שלבים של התפתחות כלי הגידול, עצה תא dynamics, היווצרות לומן, extravasation ונזק בכלי הדם מוצגים כאן. באמצעות קו eNOStag-GFP, אזורי גידול עם מיטה כלי הדם שנהרסו מאותרים בקלות על ידי מגורען שאריות הסלולר עדיין לבטא GFP. ללא סוכן להזרקה זוהה באזורים אלה, המציין את חוסר זרימה. פירושו של דבר מנוהל סוכנים כימותרפיות גם לא תגיע באזורים אלה. עם זאת, כלי הרס יכול להיות גם תוצאה טיפולית. הערכה טרום הגידול, כדי לבדוק אם טיפול טרום כלי הרס, היא תנאי מוקדם על הערכה טיפולית מדויקת, ניתן בקלות לבצע באמצעות עיצוב ניסיוני זה.
יש שפע של אפשרויות שעבורם ניתן להשתמש במיקרוסקופ intravital, דיון מפורט מעבר להיקף של פרסום זה. כדי לתת. תובנה קצרה, היישומים האפשריים כוללים מחקרים על ההצטברות של chemotherapeutics רקמת הגידול, הפיתוח של כלי (למשל, מספר כלי, סניפים, ובנקודות המפגש) ושל זרימת הדם, תא-תא אינטראקציות, תא מיקוד, עיבוד תאיים, וכן דוגמאות שהוזכרו לעיל, המוצג כאן. כמו ניתוח מבוסס על קרינה פלואורסצנטית, להיות מודע עוצמת תנודות בזכות האיכות של החלון או רקמה. כמו כן, כמו רקמת הגידול הוא יחסית עבה, זריחה מעל או מתחת למטוס של תצוגת יש השפעה על האות בתמונה. מומלץ לשלב את ניתוח כמותי תמונה עם מדידות אובייקטיביות. למשל, אם אתם מעוניינים בריכוזים סמים, להסיר את רקמת הגידול מחלון לאחר מיקרוסקופ intravital ולקבוע את התרופה תוכן באמצעות HPLC להשוות עם תמונות קונפוקלי.
ניתן לבצע הערכת התגובה הגידול כמו גם שימוש במודל זה, אבל עם כמה אמצעי. אחד חייב להבין כי גידולים גם לגדול פנימה, לתוך העור. ניתן לבצע מדידות תלת-ממד אם החדירה עמוק מספיק כדי לכסות את כל הגידול. במקרה כזה, יש להשתמש צבעי מרחיקת אדום. תא חלון כמו שמתואר כאן עסקאות עם גידולים בסביבה העור, חשוב לציין כי החלון שומרת על חום נמוך במקצת יותר הטמפרטורה בגוף העכבר הרגיל. לכן, עדיף ללמוד גידולים בהגדרת סביבתי נכון מיקרו לאשר לימודי intravital עם מהראש skinfold קאמרית חלון. חשוב, מהראש תא skinfold מציע תובנה קינטיקה של תהליכים ומנגנונים, ומספק בסיס אינסטרומנטלי עבור השיפור של טיפול. כמו כן, ניתן לקבל מידע נוסף על biodistribution ועל פרמקוקינטיקה. בסגנון קלאסי, מחקרים biodistribution אלה מבוצעים על ידי טיפול בבעלי-חיים נושאות, לנתח גידולים/איברים כדי למדוד את ספיגת התרופה. בעזרת המודל intravital המיקום intratumoral של תרופה (קרי, קרישה תוך-כלית, intratumoral, תאיים או גרעיני) יכולה להינתן5,25,26. הוא לא רק המיקום של הסם נחשף, אבל גם הזמן החלון הזדמנויות הקליטה האופטימלי ביותר.
באמצעות עיצוב ניסיוני המתוארות במאמר זה, ניתן להעריך מגוון רחב של פרמטרים באווירה הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית. באופן ספציפי, כאן אנו מראים שמיקרוסקופ intravital זה מספק תובנות חשובות הדינמיקה של התפתחות כלי הגידול, תגובה טיפולית.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות Rien ואן Haperen, ריני דה קרום על התרומה של קו eNOSTag-GFP, יוסט המקומות אקולוגיה לסיוע טכני שלו עם העבודה בעלי חיים, המטפלות בבעלי חיים על עזרתם ופיתוח שלהם. המתקנים מיקרוסקופ המשמש חלק המרכז דימות אופטי ארסמוס, אנחנו רוצים להודות לצוות OIC עבור השירות שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענק DDHK 2000-2224 מן האגודה לסרטן הולנדי, רוטרדם אוניברסיטת ארסמוס “Vereniging Trustfonds”, “Stichting ארסמוס Heelkundig Kankeronderzoek”, אנו מודים חברי הוועדות על התרומה הנדיבה שלהם.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |