Bu iletişim kuralı transgenik fareler hücre özgü floresan işaretleri ifade intravital görüntüleme açıklar. İntravital görüntüleme implante edilebilir windows üzerinden süreçlerin mikroskobik görselleştirme mümkündür kullanarak yaşayan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü gözlemler için non-invaziv bir yöntem sağlar. Bu yöntem boyuna işlemleri incelemek özellikle kullanışlıdır.
Tümör ve tümör gemi geliştirme gibi tedavi, tümör yanıt son derece dinamik biyolojik işlemlerdir. Histoloji statik bilgi sağlar ve genellikle doğru yorumu için yeterli değildir. İntravital değerlendirme, hangi süre içinde bir süreç takip eder ilave ve sık sık beklenmedik bilgiler sağlar. Transjenik hayvanlar hücrenin özgü işaretleri ve canlı hücre izleyiciler, ilerleme-e doğru görüntüleme cihazları ve çeşitli görüntüleme chambers gelişimi ifade oluşturma ile intravital mikroskobu daha iyi anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir biyolojik süreçleri. Bu kağıt bir tümör gemi geliştirme ve tedavi edici etkileri soruşturma için deneysel tasarım kayma ve zamansal bir şekilde açıklar. Bu ayarı kullanarak, gemi geliştirme, ipucu hücre ve Lümen oluşumu, kan akımı, ekstravazasyonu, kurulan vasküler yatağın ve vasküler imha aşaması görselleştirildiği takip ve. Ayrıca, tedavi edici etkileri, intratumoral kader ve kemoterapötik bileşikler lokalizasyonu da izlenebilir.
Vitro çalışmalar yüksek çözünürlüklü Kinetik görüntüleme işlemleri etkinleştirmek iken, vitro deney değerlendirme doğru bağlam içinde etkinleştirmez. Örneğin, tümör hücreleri arasındaki etkileşimin stromal bölmeleri veya ilaç dağıtım ve dağıtım bir tümör içine bir kültür tabağına okudu olamaz. Hayvan modelleri bu nedenle insan fizyolojisi ve patoloji taklit etmek için kullanılır. Ancak, süreçler, bir hücre altı çözünürlükte özellikle boyuna görüntüleme meydan okuyor. Moleküler görüntüleme yöntemleri, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi tek foton emisyon tomografi (SPECT) ve Pozitron emisyon tomografisi (PET), ama-sizlik çekmek-çözünürlük iyi penetrasyon derinliği var veya anatomik yapıları göstermek başarısız hesaplanır. Optik görüntüleme yüksek çözünürlüklü sağlar ve yapıları görüntüleme sağlar, ancak en az penetrasyon1‘ e tarafından yoksul eşlik ediyor. Uygulama penceresi ile birlikte intravital mikroskobu, bir sırt gibi teknolojileri skinfold odası veya karın pencere, yüksek çözünürlüklü görüntü vivo içinde2,3,4için sağlar. O boyuna görüntüleme için saatler günler, üzerinde görüntüleme işlemleri (Örneğin, görüntülü doku hücre-hücre etkileşimleri) doğru bağlamda ve optik sınırları çözünürlüklerde bırakmak ve farklı avantajlar, bu teknoloji vardır Gelişmiş confocal ve multiphoton mikroskoplar.
Hücre veya protein özel floresan etiketlerle Transjenik hayvanlar getirilmesi bir bolluk içinde vivo ve ex vivo Hollow’a için olanaklar açar. İçin örnek, hücre-hücre etkileşimleri, proteinleri ve manipülasyon veya tedavi yanıtı okudu bu kullanarak vivo içinde 5,6,7,8modelleri. Önemlisi, yerleştirin yer ve zaman belirlenen uygun görüntüleme ekipman ve metodoloji ile. Burada, intravital mikroskobu değiştirilmiş bir implante tümör enjekte edilebilir ajanları ile birlikte endotel bir işaretleyici ifade hayvanların sırt deri kıvrım pencere odası sunulur.
Tümör ve tümör gemi geliştirme gibi tümör tedavi edici etkileri, son derece dinamik süreçler olduğu için intravital değer biçmek zaman ve mekansal bağımlı bir şekilde bu süreçlerin doğru bir değerlendirme yapmak için zarif bir araçtır. Canlı hücre işaretleri, transgenic hayvanları yaratılması ve görüntüleme yöntemleri ilerleme artan durumu ile intravital görüntüleme ve daha popüler hale geliyor. Histoloji hala düzenli olarak kullanılır ve işaretleri çok sayıda hücreleri ve yapıları belirlemek için kullanılabilir olsa da, doku kesit dezavantajları dinamik süreçler soruşturma zaman vardır. Doku diseksiyon, yalnızca statik bilgileri sağlayan gereklidir; fiksasyon doku kalitesi etkiler; ve dilimleme hücresel etkileşimlerin zarar verir. Ayrıca, dinamik süreçler araştıran, doku diseksiyon noktalarda farklı ve sık sık tahmin ediliyor, zaman-hayvanlar büyük miktarda gerektirir. İntravital görüntüleme ile farklı oyuncuların uygun konumlandırma uzay ve zaman içinde mümkün hale aynı hayvan XYZ mekansal boyutları ve zaman fazladan bir boyut değerlendirilebilir. Bu nedenle, en iyi zaman Puan kaçırmayın ve deneme kullanılan hayvan sayısı önemli ölçüde azalır. İkinci olarak, intravital değerlendirme ile kurulan zaman penceresi doku çıkarma optimize etmek için yaygınlaştırılması. Üçüncü olarak, istenen gemi büyüme aşamasında intravitally tespit ve bir bütün-mount doku lekeli.
Bu el yazması bahsedilen intravital tasarım deri kıvrım odası modeli ve özel multiphoton confocal mikroskop Transjenik hayvanlar bir floresan etiketinde endotel hücreleri, değiştirilmiş bir dorsal ifade bir birleşimini kullanır.
Endotel hücreleri angiogenez sırasında aşamaları21,22 numarası üzerinden gidin ve bu aşamaların bir tümör genellikle aynı anda görülebilir. ENOSTag-GFP fare satırını kullanarak, tek tek endotel hücreleri takip edilmesi ve hatta filopodia dinamiği izlenebilmektedir. Bu nedenle intravitally gemi geliştirme eğitim için iyi bir model olduğunu. Zaten mevcut iç etiketleri bağlı olarak enjekte edilebilir floresan ajanlar Lümen oluşumu, kan akımı, ekstravazasyonu ve kan temizleme değerlendirmek için kullanılabilir. Fare sürekli olarak en fazla 5 saat için görüntüsü. Bir hayvan uzun vadeli değerlendirilmesi mümkün olduğunu hayvanın anestezi ile ilgili çeşitli önlemler alındığında, hangi oldu daha önce23açıklanan. Bu araştırma kanser üzerinde duruldu gibi tümör doku veya hücreleri implante edildi. Ancak, biz de ayaktarakları ve embriyonik akciğerleri ile deney. Birkaç hafta sonra regrow cilt başlar ancak, doku altında eğitim büyüme hızının, hangi-ebilmek var olmak yavaş büyüyen tümör ya da dokular ile ilgili bir sorun sınırlayıcı olduğunu.
Doğrulama aşamasında sırt deri kıvrım pencere odası önemli ölçüde güncellenmiştir klasik modeli4‘ e göre. Çerçeveler autoclavable sentetik malzemeden inşa edilir ve hafif ve küçük, büyük pencere-görünüm alanı ile. (Şekil 1Bg, beyaz ok ucu) istinat halka kanca yalnızca yüzüğü kolay kaldırılması için kullanılır. Bunlar görüntüleme ile müdahale hizmetli yüzük kanca olmadan kullanılabilir. Cilt çok fazla gevşeme bu modelde, oluşmaz uzatılmaz ve enfeksiyonlar çok nadir görülür. Bu değişiklikler hayvan rahatsızlık azaltmak ve hayvan yordam önemli ölçüde iyileştirmek. Ayrıca, metal parçalar MRI24kullanarak tümörü Imaging zaman kolayca kaldırılabilir.
Herhangi bir mikroskop intravitally görüntü dorsal kabul edilebilir deri kıvrım chambers. Ana şartı mikroskop sahne ve objektif lens arasındaki kullanılabilir alan olduğunu. Görüntüleme etkileyen önemli bir hareket yönüdür. Hareket eserler önlemek için mikroskop tabloda (tüm ekler çıkarıldıktan sonra) uyan ve fare destekleyen bir platform kullanılmalıdır. Anestezi altında ve serbestçe fare nefes izin iyidir olduğunda fare zaptetmek gerekli değildir. Ancak, pencerenin en uygun görüş alanı fiksasyonu veren platform üzerine civatalı olduğunu (Yani, tümör ile pencere odaya görünür). Platform olarak hayvan Isıtma için kullanılan bir elektronik Isıtma yastığını kullanarak ısıtılır. Özellikleri istek üzerine temin edilebilir ve bu platform şirket içinde yapıldı. Yüksek çözünürlüklü bir objektif lens hücre içi işlemler değerlendirirken bir zorunluluktur ve sitoplazma ile çekirdek arasında ayırımcılık olanak sağlar. Ama nispeten uzun iyi optik çözünürlük (yüksek NA) konik bir lens kullanımı çalışma mesafesi (tercihen 2 mm veya üzeri) önerilir. Görüntülemede penetrasyon derinliği ve etiketleri floresan yoğunluğu kısıtlamadır. Ayrıca, photobleaching, fototoksisite ve doygunluk görüntüleme sırasında kaçınılmalıdır.
Burada, entegre bir confocal multiphoton ve confocal mikroskop kullanılmıştır. Confocal ters bir mikroskop multiphoton dik, iken. Dik bir mikroskop su-daldırma lenslerin kullanımı kolay avantajdır. Bu lensler yüksek NA ve uzun bir var bir (Örneğin, 20 veya 40 X) yüksek büyütmede bile çalışma mesafesi. Özellikle, çeşitli şirketler tarafından satılan bir 20 X NA 1.0 su-daldırma lens almak için tavsiye edilir. Daldırma objektifler kullanıldığında, objektif lens ve daldırma sıvı 37 ° C’ye ısıtılmış gerektiğini, unutmayın En iyi görüntü için en uygun confocal ayarlarını kullanmak için tavsiye edilir (Yani, iğne deliği 1 havadar ünitesinde, lazer güç mümkün, kazancı çok yüksek düşük (özellikle kazanç gürültü tanıtır varsa), satır en fazla ve hiçbir taranmasını ortalama hızda). Dozun, doygunluk ve yoğunluklarda fark görüntü arasında veri kalitesi tehlikeye. Doygunluk ve overexposure önlemek için önerilir. Bu görüntüleri farklı kazanç değerlerinde elde etme tarafından atlatılabilir. Kazanç değişen görüntü parlaklığını değiştirmek için en kolay yoludur. Gerekirse, lazer güç ayarlanabilir. Görüntü kalitesini standartlaştırmak için slaytlar bir sabit floresan yoğunluğu ile kullanılabilir. Bir görüntü kalitesi bile mikroskop en iyi şekilde ayarlandığında, pencere odası ve doku kalitesi ile büyük ölçüde belirlenir akılda tutmak gerekir
Aynı anda birden çok floresan işaretleri tarama yaparken kanama-bir fluorophore bir başka kanalda algılanır aracılığıyla, kaçınılmalıdır. Taşma payı üzerinden en az örtüşen spectra ile fluorophores bir arada kullanarak ve ardışık çerçeveler arasında tarama kaçının. Burada sunulan görüntüleri 3 sıralı taramaları kullanarak tarandı (parça 1: GFP, DID veya fluor647 ile 488 ve 633 lazer; Tam2: rodamine, Doxil veya mTomato ile 543 lazer; ve izlemek 3: Höchst 405 lazer ile).
Çeşitli aşamalarında tümör gemi geliştirme, ipucu hücre dinamiği, lumen oluşumu, ekstravazasyonu ve vasküler hasar değerlendirme imkanı burada gösterilir. ENOStag-GFP satırını kullanarak, tümör alanları tahrip vasküler yatak hala GFP ifade toz hücresel artıklar tarafından kolayca algılanır. Enjekte edilebilir temsilcisi bu alanlarda, akış eksikliği gösteren algılandı. Kemoterapötik ajanlar yönetilen anlamına gelir bu alanlarda da erişemeyecektir. Ancak, gemi imha de tedavi edici bir sonuç olabilir. Ön arıtma gemi imha için kontrol etmek için tümör, ön değerlendirme doğru tedavi değerlendirmek için bir ön koşul ve kolayca bu deneysel tasarım kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Olanakları intravital mikroskobu kullanılabilir bir bolluk olduğunu ve ayrıntılı tartışma bu yayın kapsamý dýþýndadýr. Kısa bir fikir vermek için mümkün chemotherapeutics birikimi üzerine çalışmalar tümör dokusu, gemiler (Örneğin, gemiler, dalları ve kavşak sayısı) ve kan akımı, hücre-hücre etkileşimleri geliştirme uygulamaları, hedefleme ve hücre içi işleme, aynı zamanda yukarıda belirtilen ve burada gösterilen örnekler hücre. Analiz Floresans üzerinde dayalı olarak şiddeti dalgalanmalar pencere veya doku kalitesi nedeniyle dikkat. Tümör doku nispeten kalın olduğu için Ayrıca, Floresans yukarıdan veya uçak görünümünün altında görüntü sinyali etkiler. Sayısal görüntü analizi objektif ölçümleri ile birleştirmek en iyisidir. Örneğin, uyuşturucu konsantrasyonlarda ilgilenen varsa, tümör doku penceresinden sonra intravital mikroskobu kaldırmak ve uyuşturucu confocal görüntüleri ile karşılaştırmak için HPLC ile kullanarak içerik belirlemek.
Tümör yanıt değerlendirilmesi de bu modeli kullanan, ancak bazı önlemler ile gerçekleştirilebilir. Birini tümörler de içe, deri içine büyümeye gerçekleştirmek gerekir. Penetrasyon tüm tümör kapsayacak şekilde derin ise 3D ölçümler yapılabilir. Böyle bir durumda far-red boyalar kullanılır. Pencere odası olarak burada bir cilt ortamda tümörler ile fırsatlar açıklanan ve pencereyi bir sıcaklık biraz daha normal fare vücut ısısı düşük tutar işaret etmek önemlidir. Bu nedenle, bu deri kıvrım pencere odası tümörleri ile dorsal intravital çalışmalar onaylamak için şu mikro çevresel ortamda çalışmak en iyisidir. Önemlisi, dorsal deri kıvrım odası Kinetik süreç ve mekanizmaları, terapi iyileştirilmesi için bir vesile olarak sağlayan içgörü sunuyor. Ayrıca, biodistribution ve dozları hakkında ilave bilgi elde edilebilir. Klasik, bu biodistribution çalışmalar tümörü taşıyan hayvanlar tedavi ve ilaç alımı ölçmek için tümörleri/organ dissekan gerçekleştirilir. İntravital bu modeli kullanarak, bir ilaç (Yani, damar içi, intratumoral, hücre içi veya nükleer) intratumoral konumunu5,25,26sağlanabilir. Sadece, ama aynı zamanda zaman pencere-in-fırsat en optimum alımı için ortaya uyuşturucu konumudur.
Bu makalede açıklanan deneysel tasarım kullanarak, parametrelerin geniş bir zamansal ve mekansal ortamda değerlendirilebilir. Özellikle, işte bu intravital mikroskobu tümör gemi geliştirme ve terapötik yanıt dinamikleri önemli anlayışlar sağlar göstermektedir.
The authors have nothing to disclose.
Rien van Haperen ve Rini de Crom kendi geliştirme ve eNOSTag-GFP satırının, Joost A.P. Rens hayvan çalışmaları ile onun teknik yardım için ve hayvan hademe onların yardım için bağış için teşekkür etmek istiyorum. Kullanılan mikroskobu İmkanları, Erasmus optik görüntüleme Merkezi parçasıdır ve personel İKT Hizmetleri için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe DDHK 2000-2224 “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, “Vereniging Trustfonds” Erasmus Üniversitesi Rotterdam ve Hollanda Kanser Derneği tarafından desteklenen ve biz onların cömert bağış komisyonlarında üye teşekkür.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |