यहां, हम तंत्रिका अंत में मेंढक तंत्रिका स्टंप के माध्यम से एक कैल्शियम-संवेदनशील डाई लोड करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम परिधीय तंत्रिका अंत में तेजी से कैल्शियम यात्रियों के रिकॉर्डिंग और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं।
प्रीसीनेप्टिक तंत्रिका टर्मिनलों में प्रीसीनप्टिक कैल्शियम स्तर को मापने के सबसे व्यवहार्य तरीकों में से एक ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग है। यह सेल में कैल्शियम मुक्त कैल्शियम की एकाग्रता के आधार पर कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करने पर आधारित है जो कि उनके उत्सर्जन की तीव्रता या तरंग दैर्ध्य को बदलते हैं। कैल्शियम रंगों के साथ कोशिकाओं को दाग करने के कई तरीके हैं। सबसे आम एक सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से रंगों को लोड करने की प्रक्रिया है या डाईस के एटेटोक्सीमाइथाइल एस्टर रूपों के साथ पूर्व-इनक्यूबेटिंग। हालांकि, उत्पन्न होने वाली विधि संबंधी समस्याओं के कारण इन विधियों को न्यूरोस्कुल्युलर जंक्शनों (एनएमजे) पर काफी लागू नहीं होता है। इस लेख में, हम तंत्रिका अंत में मेंढक तंत्रिका के मेंढक तंत्रिका के माध्यम से एक कैल्शियम-संवेदनशील डाई लोड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। तंत्रिका टर्मिनलों में बाह्य कैल्शियम के प्रवेश और कैल्शियम डाई के बाद बाध्य होने के बाद मिलीसेकंड समय-पैमाने के भीतर होते हैं, इसलिए इन इंटरैक्शन को रिकॉर्ड करने के लिए एक त्वरित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करना आवश्यक हैएनएस। यहां, हम एक तेज सीसीडी कैमरे के साथ कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्ड करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
कैल्शियम आयन (सीए 2 + ) मध्यस्थ रिहाई 1 , 2 , 3 , 4 , 5 की दीक्षा, रखरखाव और प्लास्टिक सहित कई न्यूरॉनल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं। कार्रवाई की क्षमता के आगमन पर, बाह्य Ca 2 + तंत्रिका टर्मिनल में प्रवेश करती है और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज शुरू करती है। कुछ अन्तर्ग्रंथियों में, कैल्शियम की वर्तमानता इलेक्ट्रोफिजिकल तरीके 6 , 7 , 8 द्वारा सीधे मापा जा सकता है। न्यूरोमस्क्युलर जंक्शन (एनएमजे) के मामले में, तंत्रिका अंत के मिनट के आकार के कारण किसी प्रत्यक्ष पैच क्लैंप और दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप तकनीक का उपयोग नहीं कर सकता।
एनएमजे में तंत्रिका अंत से आवक सीए 2 + धाराओं के रिकॉर्डिंग अप्रत्यक्ष इलेक्ट्रोफिज़ द्वारा की जा सकती हैंआईोलोलॉजिकल तरीके 9 , 10 हालांकि, इन विधियों के लिए सोडियम और पोटेशियम आयन चैनल ब्लॉकर्स द्वारा संकुचन के प्रीटाएमेंट की आवश्यकता होती है। ऑप्टिकल विधियों को न्यूर टर्मिनल में आयनिक धाराओं के औषधीय पृथक्करण की आवश्यकता नहीं होती है और सीए 2 + इन्वेक्स की अनुमति के लिए रिकॉर्डिंग की अनुमति होती है, जो ऐक्शन पोटेंशिअल से उत्पन्न होती है, और एक्सओप्लाज्म 11 , 12 , 13 , 14 में सीए 2+ आयनों की बाद की ऊंचाई। इन विधियों पर सीए 2 + -सेंटिव डायरेस के प्रतिदीप्ति में सीए 2 + आयनों 15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 के बंधन पर परिवर्तन की रिकॉर्डिंग पर आधारित हैं।
सी 2 + संकेतक सी में लोड हो सकते हैंप्रयोग के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न तरीकों के माध्यम से, शोधकर्ता झिल्ली-पारगम्य डाई फॉर्म 20 , 21 के स्नान अनुप्रयोग का प्रयोग करते हैं , पैच विंदुक 22 या माइक्रोिनजेक्शन 23 , 24 , 25 के माध्यम से लोड करते हैं। हालांकि, इन सभी विधियों में एनएमजे के मामले में कुछ सीमाएं हैं, जो अन्तर्ग्रथनी आर्किटेक्टोनिक्स में अपनी विशेषताओं के कारण हैं। एनएमजे के लिए, सबसे सुविधाजनक और सफल तरीका तंत्रिका स्टंप के माध्यम से डाई को लोड करना है, एक आगे-भरने की विधि 26 , 27 , 28 , 2 9 । परिधीय तंत्रिका अंत में विभिन्न प्रतिदीप्ति रंगों को लोड करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है। ड्रोसोफिला तंत्रिका टर्मिनलों 28 , छिपकली मोटर तंत्रिका के लिए इस पद्धति का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था28 , और मेंढक मोटर तंत्रिका टर्मिनल 17 , 26 , 27 , 30 अध्ययन के तहत वस्तु के आधार पर, व्यवस्थित विवरण भिन्न हो सकते हैं। लार्वा 28 से छोटी नसों के लिए ग्लास सूक्ष्म विंदुक का इस्तेमाल किया जा सकता है कई शोधकर्ताओं ने एक विधि 27 , 28 में वर्णित किया है जिसमें एक मांसपेशियों के तंत्रिका के तंत्रिका के एक नए कटौती के अंत में डाई से भली भांति भरी हुई है। तैयार करने के बाद डाई को भिगोने के लिए कई घंटों के लिए छोड़ दिया जाता है। डाई एक्सॉन द्वारा भिगोती है और तंत्रिका टर्मिनलों में ले जाया जाता है। इस पत्र में, हम तंत्रिका स्टंप के माध्यम से मेंढक मोटर तंत्रिका टर्मिनलों में प्रतिदीप्ति सूचक को लोड करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल एक डाई के साथ ऊतक के ऊष्मायन के लिए एक प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग करता है हम यह भी वर्णन करते हैं कि सीए 2 + फ्लोरोसेंटेंस ट्रे का अधिग्रहण और विश्लेषण कैसे करेंnsients।
इस पत्र में, हमने तंत्रिका स्टंप के माध्यम से मेंढक तंत्रिका अंत में सीए 2 + -सेन्सिटिव डाई लोडिंग करने की विधि प्रस्तुत की। लोडिंग प्रक्रिया के अंत तक, तंत्रिका के समीपस्थ भाग में सभी टर्मिनल प्रतिदीप्ति के महत्वपूर्ण स्तर हैं। यह अनुमान लगाया गया है कि जांच का अंतर-टर्मिनल एकाग्रता 40 और 150 माइक्रोन 17 के बीच भिन्न होता है।
ऊष्मायन प्रक्रिया दो चरणों में आयोजित की जाती है: कमरे के तापमान पर और फिर एक रेफ्रिजरेटर में कम तापमान पर। कमरे के तापमान पर डाई के साथ ऊतक ऊष्मायन के समय को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। तंत्रिका स्टंप की वास्तविक लंबाई, विशिष्ट रंग और तापमान पर निर्भर करते हुए, ऊष्मायन समय भिन्न हो सकता है। यदि ओवरेक्स्पोज़्ड होता है, तंत्रिका स्टंप के नजदीक समीपस्थ भागों में टर्मिनल ओवरलोड हो सकते हैं। हालांकि, तंत्रिका के मध्य भाग में, यह अभी भी संभव है कि जो टर्मिनल संतोषजनक रूप से लोड किए जाते हैं। के दौरानई रेफ्रिजरेटर में लंबी ऊष्मायन, डाई समान तंत्रिका अंत पर वितरित किया जाता है।
33 , 35 के साथ-साथ अन्य शोधकर्ताओं के आंकड़ों के अनुसार, पोस्टऑनटैप्टिक प्रतिक्रिया के आयाम या लघु अंत प्लेट क्षमता की आवृत्ति पर लदान प्रक्रिया के किसी भी प्रभावशाली प्रभाव की कमी साबित होते हैं। भरी हुई तैयारी में अच्छे दीर्घायु का दस्तावेजीकरण किया गया था। कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर हम ध्यान आकर्षित करना चाहते हैं। कटौती तंत्रिका के axons में प्रवेश करने के लिए डाई सक्षम करने के लिए छिद्र के बाद भीतर मिनट के भीतर डाई-लोडिंग समाधान में तंत्रिका स्टंप लगाने के लिए बहुत आवश्यक है; देरी अप्रभावी लोडिंग का कारण हो सकती है, संभाव्यतः तंत्रिका एक्सॉन 27 , 36 के शोधन के कारण। कुछ जांचकर्ताओं ने तंत्रिका स्टंप को 100 एमएम EDTA (एक सीए 2 + – और एमजी 2 + – सीएलएटर में विसर्जित कर दिया है)) ने शोधन से कट एक्सॉन को रोकने के लिए तंत्रिका के छानने के तुरंत बाद। बफर 1-2 मिनट के बाद निकाल दिया जाता है और डाई लोडिंग समाधान 37 के साथ बदल दिया जाता है। लोडिंग प्रक्रिया के लिए प्लास्टिक टयूबिंग के बजाय पेट्रोलियम-जेली का उपयोग छोटे नर्व स्टंप के उपयोग की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय, डाई के साथ HEPES समाधान में विसर्जित होने के बाद तंत्रिका काट दिया जाता है, और डाई समाधान 27 , 28 में द्विपक्षीय आयनों की कमी के कारण अक्षतंतु शोध नहीं करते हैं।
हमारे अध्ययन में, हमने डेक्सट्रान के बजाय सीए 2 + इंडिकेटर के पानी में घुलनशील नमक का इस्तेमाल किया। डेक्सट्रान संयुग्म अक्षांश में अधिक नम्र रूपों की तुलना में धीरे धीरे फैलता है। हालांकि, डेक्सट्रान संयुग्म का उपयोग तंत्रिका और एनएमजे द्वारा डाई कम्पोबर्टलैजेशन और हैंडलिंग को कम करता है। कैल्शियम ग्रीन 1-3,000 मेगावाट डेक्सट्रान संयुग्तु का एक अच्छा प्रसार दर है और कम कंपौटलाइजेशन दर्शाता है <s अप क्लास = "xref"> 38
टिशू के फ्लोरोसेंट रोशनी की लंबी अवधि से बचने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह उसके स्वास्थ्य और अस्तित्व को प्रभावित करता है। हम तंत्रिका टर्मिनलों की खोज के लिए दृश्य-प्रकाश चैनल में नोर्मास्की ऑप्टिक्स का उपयोग करते हैं। रिकॉर्डिंग के दौरान, हम एक डायाफ्राम का उपयोग करके प्रबुद्ध क्षेत्र को सीमित करते हैं।
यह उल्लेखनीय है कि यह लोडिंग पद्धति केवल तैयारी के लिए उपयुक्त है, जो लंबे समय तक इनक्यूबेशन का सामना कर सकती है। डाई लोडिंग के समय को कम करने के लिए जब अधिक नाजुक ऊतकों ( उदाहरण के लिए, गर्म रक्त वाले जानवरों के संक्रमण) पर अध्ययन किया जा रहा है, तो तंत्रिका स्टंप लंबाई को कम करने और 29 , 3 9 लोड करने के लिए माइक्रोप्रोपेटेस का उपयोग करने के लिए आवश्यक है।
यह लोडिंग तकनीक साइटोसोलिक सीए 2 + में इमेजिंग बदलावों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जिसमें एकल तंत्रिका उत्तेजना और तालबद्ध अन्तर्ग्रथनी गतिविधि दोनों के तहत फ्लोरोसेंट संकेतकों के साथईईएफ "> 17 , 27 , 35. सीए 2 + ट्रान्सियंट आयाप का विश्लेषण कैल्शियम एंट्री पर विभिन्न पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 33 में भाग लेता है।
The authors have nothing to disclose.
यह अनुसंधान रूसी सरकार के कार्यक्रम के लिए कज़ान संघीय विश्वविद्यालय के प्रतियोगी विकास के लिए और मूल अनुसंधान के लिए रूसी फाउंडेशन (16-04-01051, 16-34-00817, 15-04-02983) से अनुदान के तहत किया गया था। पांडुलिपि के पहले ड्राफ्ट पर सहायक टिप्पणियां प्रदान करने के लिए हम चार अनाम समीक्षकों का धन्यवाद करते हैं। हम आवाज रिकॉर्डिंग के लिए यूलिया अरात्स्काय के लिए हमारी कृतज्ञता व्यक्त करते हैं। हम कई उपयोगी टिप्पणियों और पांडुलिपि के अंतिम संपादन के साथ मदद के लिए डॉ। विक्टर इलिन के लिए आभारी हैं।
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
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Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |