Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
Adaptive Reaktion ist von entscheidender Bedeutung für die bakterielle Überlebenszeit. Um Umweltveränderungen zu erfassen und zu reagieren, können Bakterien, die eine Stimulus-Antwort-System als Zweikomponenten-Signalisierung bekannt. 1,2 In einem typischen Zweikomponentensystem wird die Histidinkinase detektiert einen kognaten Stimulus, autophosphoryliert seinen konservierten Histidinrest, überträgt dann Phosphat zu einem konservierten Aspartatrest auf dem Empfänger – Domäne eines Response – Regulator – Protein. 3 Dieses Ereignis löst eine Veränderung in der Aktivität des Antwortregulator, der ein stromabwärtiges Effekt anregt. 4,5 Daher Bakterien können zu Veränderungen in der lokalen Umgebung zu erfassen und anzupassen. Einige Zwei-Komponenten-Signalanlagen weichen von diesem Urbild. In einigen Fällen ist die sensorische Domäne der Histidinkinase eine Stand-alone-Protein, das direkt die Sinnes erkennt und modifiziert Kinase-Aktivität durch eine Protein-Protein-Interaktion. 6 – 8 jedoch der Fondsamental Verfahren und allgemeine Rolle des Systems bleibt gleich. Zweikomponenten-Signalisierung ist ein allgegenwärtiges Stimulus-Antwort-System, das essentiell für das Überleben bakterieller ist und Histidin-Kinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Transduktion des Signals. 9
Trotz der Bedeutung von Histidin-Kinasen bakterielle biology, bleiben sie schlecht charakterisiert. Dies ist aufgrund der inhärenten Instabilität von Phosphohistidin, und das Fehlen eines praktischen Verfahrens zur Messung Autophosphorylierung. Phosphohistidin ist labiler als Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin. 10 So Techniken , die häufig verwendet werden , Ser / Thr / Tyr – Kinasen sind nicht anwendbar für Histidinkinasen zu analysieren. 11 In – vitro – Assays Histidin – Kinasen zu untersuchen wurden weitgehend auf SDS-PAGE – Autoradiographie beschränkt. 12,13 In diesem Verfahren [γ- 32 P] -ATP ist mit der Kinase inkubiert, und die Phosphorylierung der Kinase wird durch pol analysiertyacrylamide Gelelektrophorese (PAGE), gefolgt von Autoradiographie des Gels. Dieses Verfahren kann verwendet werden kinase Autophosphorylierung zu überwachen sowie Phosphotransfer aus der Kinase zu einem Antwortregulator. Jedoch hat dieses Verfahren bemerkenswerte Mängel. PAGE-basierten Assays sind niedrigen Durchsatz und zeitraubend. Solche Einschränkungen sind nicht förderlich für ein Protein zu charakterisieren, und seine kinetischen Parameter ermitteln. Eine alternative Methode Histidinkinasen für die Untersuchung, die vor kurzem nutzt Phosphohistidindomäne Antikörper veröffentlicht wurde Autophosphorylierung zu erkennen. 14 Während dieses Verfahren den Vorteil des Unterscheidens zwischen 1-und 3-Phosphohistidin Phosphohistidin hat, abhängig von der Instrumentierung zur Detektion verwendet, ist diese Methode nicht einen großen Dynamikbereich und hohe obere Nachweisgrenze anbieten. Somit besteht ein Bedarf für eine schnellere, weniger arbeitsaufwendig und empfindlicher Assay, der verwendet werden kann, diese wichtigen Proteine zu untersuchen.
Hier beschreiben wir und demonstrate eine sorgfältig entwickelte Nitrocellulose – Bindungsassay, der verwendet werden kann , die Autophosphorylierung des gereinigten bakteriellen Histidin – Kinasen in vitro zu quantifizieren. Dieser Assay ist ein höherer Durchsatz und weniger zeitraubend als PAGE-basierten Assays. Das Verfahren verwendet auch Cherenkov-Strahlung für Phosphohistidin Quantifizierung, die eine hohe obere Grenze der Detektion und einen großen Dynamikbereich bietet. Der Assay kann verwendet werden, um die kinetischen Parameter für Histidin-Kinasen bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Nitrocellulose-Bindungstest wir beschrieben haben, hat viele Vorteile gegenüber bisher verwendeten Verfahren Histidin-Kinasen zu charakterisieren. Im Vergleich zu herkömmlichen SDS / PAGE-basierten Autoradiographie, ist unser Verfahren einen höheren Durchsatz und weniger zeitraubend. Die Nitrocellulosemembran ist leichter zu handhaben als SDS-Gelen, und braucht nicht befestigt zu werden. Ponceau-Färbung der Nitrocellulose ermöglicht die Proteinspots visualisiert werden. Dies bietet eine einfache Möglichkeit, j…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Department of Education durch die Graduate Unterstützung in Bereichen der nationalen Not-Programm (P200A100044) unterstützt.
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
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