बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण और स्वतंत्र, निष्पक्ष क्लस्टरिंग रूपात्मक मैट्रिक्स के आधार पर चुनिंदा आबादी में न्यूरॉन्स वर्गीकृत करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल एक संशोधित रेबीज वायरस फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त, और स्वतंत्र, निष्पक्ष क्लस्टर का विश्लेषण करती है कि अलग न्यूरोनल उपवर्गों के बीच रूपात्मक मैट्रिक्स की व्यापक लक्षण वर्णन सक्षम साथ प्रतिगामी संक्रमण के बाद चयनात्मक neuronal आबादी के बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण, लेबल का वर्णन है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल स्वतंत्र और निष्पक्ष क्लस्टरिंग के उपयोग के साथ संयुक्त न्यूरॉन्स की बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण रूपात्मक एक चयनात्मक न्यूरोनल आबादी के बीच मनाया विशेषताओं का एक व्यापक सर्वेक्षण बनाने के लिए विश्लेषण की रूपरेखा। इन तकनीकों के संयोजन संग्रह और neuroanatomical डेटा के विश्लेषण के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का गठन किया। साथ में, इन तकनीकों का बड़े पैमाने पर सक्षम है, और इसलिए अधिक व्यापक, चयनात्मक neuronal आबादी का नमूना और आबादी के भीतर आकृति विज्ञान अद्वितीय न्यूरोनल कक्षाओं वर्णन करने के लिए निष्पक्ष मात्रात्मक तरीकों की स्थापना।
प्रोटोकॉल संशोधित रेबीज वायरस का उपयोग चुनिंदा न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए रूपरेखा। जी-हटाए ब्याज का लक्ष्य मस्तिष्क संरचना में stereotaxic इंजेक्शन के बाद एक प्रतिगामी दरियाफ्त की तरह रेबीज वायरस काम करता है और न्यूरॉन्स में वितरण और EGFP की अभिव्यक्ति के लिए एक वाहन के रूप में कार्य करता है। न्यूरॉन्स के बड़ी संख्या में इस का उपयोग संक्रमित हैंतकनीक और उनके dendrites भर में व्यक्त GFP, "Golgi की तरह" व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पूरी भरता का निर्माण किया। तदनुसार, वायरस की मध्यस्थता प्रतिगामी त्रुटि विधि पूरा intracellular भरता निर्माण करके पारंपरिक डाई आधारित प्रतिगामी ट्रेसिंग तकनीक पर सुधार।
व्यक्तिगत अच्छी तरह से पृथक अध्ययन के तहत मस्तिष्क क्षेत्र के सभी क्षेत्रों में फैले न्यूरॉन्स आदेश न्यूरॉन्स के एक प्रतिनिधि नमूने प्राप्त करने के लिए पुनर्निर्माण के लिए चुने गए हैं। प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं सेल निकायों के पुनर्निर्माण और कई ऊतक वर्गों में फैले लेबल न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान द्रुमायण पैटर्न को पूरा करने की रूपरेखा। मस्तिष्क की संरचना के भीतर प्रत्येक न्यूरॉन के पदों सहित रूपात्मक डेटा, आगे के विश्लेषण के लिए निकाले जाते हैं। मानक प्रोग्रामिंग कार्यों स्वतंत्र क्लस्टर विश्लेषण करती है और क्लस्टर रूपात्मक मैट्रिक्स के आधार पर मूल्यांकन प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया गया। इन विश्लेषण की उपयोगिता, एक क्लस्टर विश्लेषण perfo के सांख्यिकीय मूल्यांकन सत्यापित करने के लिए160 मकाक बंदर के चेतक (TRN) की thalamic जालीदार नाभिक में खंगाला न्यूरॉन्स पर rmed बनाया गया था। दोनों मूल क्लस्टर विश्लेषण और सांख्यिकीय यहां प्रदर्शन के मूल्यांकन से संकेत मिलता है कि टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स तीन उप-जनसंख्या, अद्वितीय रूपात्मक विशेषताओं के साथ प्रत्येक में अलग हो रहे हैं।
Introduction
Neuroanatomy "connectomics" में तंत्रिका विज्ञान के 1 और हाल ही में ब्याज की नींव में से एक neuronal आबादी की रूपात्मक विविधता और विशिष्ट न्यूरॉन्स 2 के बीच कनेक्शन को समझने के लिए उत्साह से नए सिरे से किया गया है। दृष्टिकोण 3, 4, 5 neuronal आबादी का अधिक व्यापक रूपात्मक सर्वेक्षणों को सक्षम करने लेबलिंग के लिए तरीके और पुनर्निर्माण न्यूरॉन्स बहुत आनुवंशिक और वायरस की मध्यस्थता सर्किट ट्रेसिंग सहित हाल ही में नवाचारों के साथ सुधार हुआ है। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स लेबलिंग के क्षेत्र में सुधार के अलावा, मात्रात्मक डेटा विश्लेषण तकनीक भी है कि रूपात्मक डेटा 5, 6 के आधार पर अलग-अलग उप-जनसंख्या में न्यूरॉन्स की स्वतंत्र और निष्पक्ष वर्गीकरण सक्षम उभरा है। ये निष्पक्ष तकनीक अधिक traditiona पर एक सुधार कर रहे हैंएल गुणात्मक वर्गीकरण के तरीकों है कि एक सदी से भी अधिक क्षेत्र में मानक की गई है। इस अध्ययन का लक्ष्य, रूपरेखा कदम-दर-कदम पर है, एक चयनात्मक आबादी के भीतर न्यूरॉन्स के वायरस की मध्यस्थता लेबलिंग के संयोजन, इन न्यूरॉन्स की एक व्यापक नमूना है, और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण के साथ स्वतंत्र क्लस्टरिंग पर आधारित सांख्यिकीय मूल्यांकन। इन विधियों के संयोजन से, हम एक चयनात्मक न्यूरोनल आबादी के भीतर व्यापक नमूना और आकृति विज्ञान अद्वितीय neuronal प्रकार की निष्पक्ष वर्गीकरण की सुविधा के लिए संग्रह और neuroanatomical आंकड़ों के विश्लेषण की ओर एक उपन्यास दृष्टिकोण की रूपरेखा।
इन तरीकों में से एक उदाहरण के रूप में, हम मकाक बंदर की thalamic जालीदार नाभिक (TRN) के एक ही क्षेत्र के भीतर न्यूरॉन्स की एक बड़ी आबादी के हमारे विश्लेषण का वर्णन है। ये आंकड़े एक पूर्व अध्ययन 7 से हैं। चुनिंदा पृष्ठीय latera को पेश टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए तरीकेचेतक (dLGN) संशोधित रेबीज वायरस EGFP 4, 8 एनकोडिंग की शल्य इंजेक्शन का उपयोग कर के एल geniculate नाभिक (विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्ति 2 की तालिका देखें) रेखांकित कर रहे हैं। इस संशोधित रेबीज वायरस जीन, एक आवश्यक कोट प्रोटीन एन्कोडिंग वायरस के पार synaptic आंदोलन को नष्ट करने का अभाव है। एक बार वायरस इंजेक्शन स्थल पर अक्षतंतु टर्मिनल में प्रवेश करती है, यह संक्रमित न्यूरॉन्स 5, 9, 10 से भरे वृक्ष के समान द्रुमायण भर EGFP अभिव्यक्ति ड्राइविंग के महत्वपूर्ण लाभ के साथ एक पारंपरिक प्रतिगामी दरियाफ्त की तरह कार्य करता है। तदनुसार, इस जी-हटाए रेबीज वायरस चुनिंदा संक्रमित हैं और इंजेक्शन और प्रतिगामी परिवहन के बाद किसी भी न्यूरोनल जनसंख्या लेबल करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
आदेश में एक विशिष्ट neuronal आबादी का एक व्यापक विश्लेषण प्रदर्शन करने में, यह से नमूना करने के लिए महत्वपूर्ण हैआबादी के भीतर न्यूरॉन्स की एक व्यापक वितरण। क्योंकि वायरस की मध्यस्थता लेबलिंग तकनीक पूरा intracellular पैदा करता है, "Golgi की तरह" वायरस इंजेक्शन स्थल पर एक्सोन के साथ कई न्यूरॉन्स की भरता है, यह एक मस्तिष्क संरचना की पूर्ण सीमा के भीतर न्यूरॉन्स की एक बहुत बड़ी नमूना फिर से संगठित करने के लिए संभव है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि संशोधित रेबीज वायरस से संक्रमण और न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या लेबलिंग में बहुत प्रभावी है, यह संभव प्रति पशु न्यूरॉन्स के सैकड़ों फिर से संगठित करने के लिए है। आदेश dLGN पेश टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की एक व्यापक नमूना उत्पन्न करने में टूर्नामेंट्स 11 के दृश्य क्षेत्र भर में 160 न्यूरॉन्स नमूना लेने के लिए प्रक्रिया रेखांकित कर रहे हैं। व्यक्ति एक माइक्रोस्कोप, कैमरा, और पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर सहित एक न्यूरॉन पुनर्निर्माण प्रणाली का उपयोग कर न्यूरॉन्स के पुनर्निर्माण की प्रक्रिया में वर्णित है। इसके अलावा वर्णित (टूर्नामेंट्स के भीतर इस मामले में) एक मस्तिष्क संरचना के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की स्थिति निर्धारित करने के लिए और वायरस इंजेक्शन एसआईटी को सत्यापित करने के तरीके हैंई की मात्रा और एक संरचना (dLGN के भीतर इस मामले में) के भीतर स्थान बड़ा समोच्च पुनर्निर्माण का उपयोग कर। रूपात्मक डेटा निर्यात और स्वतंत्र क्लस्टर प्रदर्शन करने के लिए कदम पर प्रत्येक न्यूरॉन के लिए मापा रूपात्मक मेट्रिक्स रेखांकित कर रहे हैं आधारित विश्लेषण करती है। वहाँ क्लस्टरिंग तरीकों के लिए सीमाएं हैं और वहाँ भी उपलब्ध विभिन्न क्लस्टरिंग एल्गोरिदम की एक किस्म है। तदनुसार, इन विकल्पों और अधिक आमतौर पर इस्तेमाल किया एल्गोरिदम में से कुछ का लाभ वर्णित हैं। क्लस्टर विश्लेषण समूहों की विशिष्टता के सांख्यिकीय सत्यापन प्रदान नहीं करता है। इसलिए, अतिरिक्त कदम इष्टतम क्लस्टरिंग के साथ ही भीतर और समूहों भर में रूपात्मक डेटा के बीच रिश्तों को सत्यापित करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं। टूर्नामेंट्स डाटासेट के लिए समूहों का मूल्यांकन कि टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की पुष्टि करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों तीन अद्वितीय 10 स्वतंत्र रूपात्मक मेट्रिक्स वर्णित हैं पर आधारित समूहों में बांटा जाता है।
इस प्रकार, चुनिंदा लेबलिंग के लिए कदम रूपरेखा द्वारा, पुनर्निर्माण, और एक विशिष्ट neuronal आबादी से रूपात्मक डेटा का विश्लेषण, हम एक आबादी के भीतर न्यूरॉन्स के बीच मतभेद रूपात्मक बढ़ाता के लिए विधियों का वर्णन। मकाक बंदर टूर्नामेंट्स के दृश्य क्षेत्र के भीतर अलग neuronal प्रकार की पूर्व निष्कर्ष अलग सांख्यिकीय मूल्यांकन के तरीकों के साथ इस बात की पुष्टि कर रहे हैं। साथ में, हम आशा है कि इन तकनीकों को मोटे तौर पर neuroanatomical डेटासेट के लिए लागू हो सकता है और मस्तिष्क के माध्यम से neuronal आबादी की विविधता के मात्रात्मक वर्गीकरण स्थापित करने में मदद करेगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuroanatomical अध्ययनों से बनी है तंत्रिका विज्ञान और connectomics और संरचना समारोह संबंधों में हाल ही में ब्याज का एक स्तंभ चयनात्मक neuronal आबादी की विस्तृत रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए नए सिरे से उत्साह गया है। परंपरागत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस को धन्यवाद देना चाहेंगे। एड कालावे और हमें ऊतक एक पूर्व अध्ययन और लिब्बी Fairless और Shiyuan लियू न्यूरोनल पुनर्निर्माण के साथ मदद के लिए के एक भाग के रूप में तैयार उपयोग करने की अनुमति के लिए मार्टी Usrey। और व्हाइटहॉल फाउंडेशन: यह काम एनआईएच (EY018683 नै) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
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