Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives
Summary
Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle des populations neuronales sélectives, marquées après l'infection rétrograde avec un virus de la rage modifiée exprimant des marqueurs fluorescents, et des analyses indépendantes, impartiales grappe qui permettent la caractérisation complète des paramètres morphologiques parmi les sous-classes neuronales distinctes.
Abstract
Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle de neurones associés à l'utilisation de regroupement indépendant et impartial des analyses pour créer une enquête exhaustive sur les caractéristiques morphologiques observées chez une population neuronale sélective. La combinaison de ces techniques constitue une nouvelle approche pour la collecte et l'analyse des données neuroanatomiques. Ensemble, ces techniques permettent à grande échelle, et donc plus complète, l'échantillonnage des populations neuronales sélectives et d'établir des méthodes quantitatives impartiales pour décrire les classes de neurones morphologiquement uniques au sein d'une population.
Le protocole décrit l'utilisation du virus de la rage modifié pour marquer sélectivement les neurones. G supprimé les actes du virus de la rage, comme un traceur rétrograde après l'injection stéréotaxique dans une structure cible du cerveau d'intérêt et sert de véhicule pour la délivrance et l'expression de l'EGFP dans les neurones. Un grand nombre de neurones sont infectés en utilisant cestechnique et d'exprimer la GFP à travers leurs dendrites, produisant "Golgi-like" remplissages complets de neurones individuels. En conséquence, le procédé de traçage rétrograde à médiation virale améliore les techniques de traçage rétrograde à base de colorants traditionnels par la production intracellulaire remplissages complets.
Individuels neurones bien isolées couvrant toutes les régions de la zone du cerveau à l'étude sont sélectionnés pour la reconstruction afin d'obtenir un échantillon représentatif des neurones. Le protocole décrit les procédures de reconstruction des corps cellulaires et de compléter les modèles arborisation dendritique des neurones marqués couvrant des sections de tissus multiples. Les données morphologiques, y compris les positions de chaque neurone dans la structure du cerveau, sont extraites pour analyse ultérieure. fonctions de programmation standard ont été utilisées pour effectuer des analyses et des grappes indépendantes évaluations groupées basées sur des mesures morphologiques. Pour vérifier l'utilité de ces analyses, l'évaluation statistique d'un perfo d'analyse de clusterrmée sur 160 neurones reconstruits dans le noyau réticulaire thalamique du thalamus (TRN) du singe macaque a été faite. Tant l'analyse de cluster d'origine et les évaluations statistiques réalisées ici indiquent que les neurones TRN sont séparés en trois sous-populations, chacune avec ses caractéristiques morphologiques uniques.
Introduction
Neuroanatomy est l' un des fondements de la neuroscience 1 et de l' intérêt récent "connectomique" a renouvelé l' enthousiasme pour la compréhension de la diversité morphologique des populations neuronales et les connexions entre les neurones spécifiques 2. Des procédés de marquage et les neurones reconstruisant ont grandement amélioré avec des innovations récentes, y compris circuit traçage génétique et virus médiée par des approches 3, 4, ce qui permet des enquêtes morphologiques plus complètes des populations neuronales 5. En plus des améliorations dans l' étiquetage des neurones individuels, les techniques d'analyse de données quantitatives sont également apparues qui permettent la classification indépendante et impartiale des neurones en sous – populations distinctes fondées sur des données morphologiques 5, 6. Ces techniques impartiales sont une amélioration sur plus traditional méthodes de classification qualitatives qui ont été la norme dans le domaine depuis plus d'un siècle. Le but de cette étude est de décrire, étape par étape, la combinaison de l'étiquetage des virus médiée par des neurones au sein d'une population sélective, reconstructions à grande échelle d'un échantillon global de ces neurones, et l'analyse quantitative de données basée sur le regroupement indépendant avec évaluation statistique. En combinant ces méthodes, nous présentons une nouvelle approche vers la collecte et l'analyse des données neuroanatomiques pour faciliter l'échantillonnage complet et classification objective des types de neurones morphologiquement uniques au sein d'une population neuronale sélective.
A titre d'exemple de ces méthodes, nous décrivons l'analyse d'une large population de neurones dans un seul secteur du noyau thalamique réticulaire (TRN) du macaque. Ces données proviennent d'une étude préalable 7. Méthodes d'étiquetage sélectivement les neurones TRN en saillie à l'latera dorsalel genouillée noyau du thalamus (dLGN) par injection chirurgicale du virus de la rage modifié codant EGFP 4, 8 (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 2) sont décrites. Ce virus de la rage modifié est dépourvu du gène codant pour une protéine d'enveloppe essentielle, ce qui élimine le mouvement trans-synaptique du virus. Une fois que le virus pénètre dans les terminaisons axonales au site d'injection, il agit comme un traceur rétrograde traditionnel avec l'avantage important de conduire l' expression EGFP dans toute la arborisation dendritique complète des neurones infectés 5, 9, 10. En conséquence, ce virus de la rage G deletion peut être utilisée pour infecter et marquer une population neuronale après l'injection et le transport rétrograde de manière sélective.
Afin d'effectuer une analyse complète d'une population neuronale spécifique, il est important d'échantillonnerune large distribution des neurones au sein de la population. Étant donné que la technique de marquage à médiation virale produit intracellulaire complet, remplit de nombreux neurones avec des axones au niveau du site d'injection de virus "Golgi-like», il est possible de reconstruire un grand échantillon de neurones au sein de l'étendue de la structure du cerveau. En outre, parce que le virus de la rage est modifiée de manière efficace à infecter et à étiqueter un grand nombre de neurones, il est possible de reconstruire des centaines de neurones par animal. Les procédures d'échantillonnage de 160 neurones dans tout le secteur visuel de la TRN 11 afin de générer un échantillon complet de neurones se projetant dLGN-TRN sont décrits. Le processus de reconstruction des neurones individuels à l'aide d'un système de reconstruction de neurones comprenant un microscope, une caméra, et un logiciel de reconstruction est décrit. On décrit également des méthodes pour déterminer les positions des neurones individuels au sein d'une structure du cerveau (dans ce cas au sein de la TRN) et de vérifier le virus sit d'injectionle volume de courrier et un emplacement à l'intérieur d'une structure (dans ce cas dans le dLGN) en utilisant des reconstructions de contour volumétrique. Étapes à suivre pour exporter des données morphologiques et effectuer grappe indépendante analyses fondées sur des paramètres morphologiques mesurés pour chaque neurone sont décrites. Il y a des limites aux méthodes de classification et il y a aussi une variété de différents algorithmes de clustering disponibles. En conséquence, ces options et les avantages de certains des algorithmes les plus couramment utilisés sont décrits. L'analyse de cluster ne fournit pas la vérification statistique de l'unicité de clusters. Par conséquent, des étapes supplémentaires sont décrites afin de vérifier le regroupement optimal, ainsi que les relations entre les données morphologiques au sein et entre les clusters. Méthodes statistiques pour évaluer les clusters pour l'ensemble de données TRN pour confirmer que les neurones TRN sont regroupés en trois groupes uniques basé sur 10 paramètres morphologiques indépendants sont décrits.
Ainsi, en décrivant les étapes pour l'étiquetage sélective, La reconstruction et l'analyse des données morphologiques d'une population neuronale spécifique, nous décrivons des procédés permettant de quantifier des différences morphologiques entre les neurones au sein d'une population. les résultats antérieurs des types neuronaux distincts au sein du secteur visuel du singe macaque TRN sont confirmées avec des méthodes d'évaluation statistiques distinctes. Ensemble, nous espérons que ces techniques seront largement applicables aux ensembles de données neuroanatomiques et aider à établir la classification quantitative de la diversité des populations neuronales dans le cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études neuroanatomiques sont restés un pilier des neurosciences et de l'intérêt récent pour connectomique et relations structure-fonction a renouvelé l'enthousiasme pour la caractérisation morphologique des populations neuronales sélectives. Traditionnellement, les études neuroanatomiques se sont appuyés sur les classifications qualitatives des neurones dans des classes morphologiquement distinctes de neurones définis par neuroanatomistes experts. Avec les progrès dans les techniques de reconstru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les Drs. Ed Callaway et Marty Usrey pour nous permettre d'utiliser le tissu préparé comme une partie d'une étude préalable et Libby Fairless et Shiyuan Liu pour l'aide avec reconstructions neuronales. Ce travail a été financé par le NIH (NEI: EY018683) et la Fondation Whitehall.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
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