Storskaliga rekonstruktioner och oberoende, opartisk Kluster Baserat på morfologiska Metrics att klassificera nervceller i selektiva populationer
Summary
Detta protokoll beskriver storskaliga rekonstruktioner av selektiva neuronala populationer, märkta efter retrograd infektion med ett modifierat rabiesvirus som uttrycker fluorescerande markörer, och oberoende, opartisk kluster analyser som möjliggör omfattande karakterisering av morfologiska statistik bland distinkta neuronala klasser.
Abstract
Detta protokoll beskriver storskaliga rekonstruktioner av nervceller i kombination med användning av oberoende och opartisk klustring analyser för att skapa en omfattande undersökning av de morfologiska egenskaperna observerades bland en selektiv neuronal population. Kombination av dessa tekniker utgör en ny metod för insamling och analys av neuroanatomiska data. Tillsammans utgör dessa tekniker möjliggör storskalig och därmed mer omfattande provtagning av selektiva neuronala populationer och fastställa objektiva kvantitativa metoder för att beskriva morfologiskt unika neuronala klasser inom en population.
Protokollet beskriver användningen av modifierat rabiesvirus för att selektivt märka nervceller. G-utgår rabiesvirus fungerar som en bakåtsträvande spårämne efter stereotaktisk injektion i ett mål hjärnans struktur av intresse och fungerar som en vehikel för leverans och uttryck av EGFP i nervceller. Ett stort antal nervceller infekteras med hjälp av dennateknik och uttrycka GFP hela deras dendriter, som producerar "Golgi-liknande" kompletta fyllningar av enskilda nervceller. Följaktligen förbättrar virusmedierad retrograd spårning metod på traditionella färgämnesbaserade retrograd spårning tekniker genom att producera kompletta intracellulära fyllningar.
Individuella välisolerade nervceller som spänner över alla regioner i hjärnan området under studien ut för återuppbyggnad för att få ett representativt urval av nervceller. Protokollet beskriver förfaranden för att rekonstruera cellkroppar och slutföra dendritiska arborization mönster av märkta nervceller som spänner över flera vävnadssnitt. Morfologiska data, inklusive lägen för varje neuron i hjärnans struktur, extraheras för vidare analys. Standardprogrammeringsfunktioner användes för att utföra oberoende kluster analyser och kluster utvärderingar baserade på morfologiska statistik. För att verifiera användbarheten av dessa analyser, statistisk utvärdering av en klusteranalys performed på 160 neuroner rekonstruerade i thalamus retikulära kärnan i thalamus (TRN) av makakapa gjordes. Både den ursprungliga klusteranalys och statistiska utvärderingar här tyder på att TRN nervceller är uppdelade i tre underpopulationer, var och en med unika morfologiska egenskaper.
Introduction
Neuroanatomi är en av grundvalarna för neurovetenskap 1 och nyligen intresse "connectomics" har förnyat entusiasm för att förstå morfologiska mångfalden av neuronala populationer och sambanden mellan specifika nervceller 2. Metoder för märkning och återuppbygga nervceller har förbättrats avsevärt med nya innovationer, inklusive genetiska och virus-medierad krets spårning närmar 3, 4, vilket möjliggör mer omfattande morfologiska undersökningar av neuronala populationer 5. Förutom förbättringar i märkning enskilda nervceller har kvantitativa data analystekniker också framkommit att möjliggöra oberoende och opartisk klassificering av nervceller i distinkta subpopulationer baserade på morfologiska uppgifter 5, 6. Dessa objektiva tekniker är en förbättring på mer traditional kvalitativa klassificeringsmetoder som har varit standard på området i över ett sekel. Målet med denna studie är att beskriva, steg-för-steg, kombinationen av virus-medierad märkning av nervceller i en selektiv population storskaliga rekonstruktioner av en omfattande urval av dessa neuroner, och kvantitativ analys av data baserad på oberoende klustring med statistisk utvärdering. Genom att kombinera dessa metoder vi skissera ett nytt tillvägagångssätt mot insamling och analys av neuroanatomiska data för att underlätta omfattande provtagning och opartisk klassificering av morfologiskt unika neuronala typer inom en selektiv neuronal population.
Som ett exempel på dessa metoder, beskriver vi vår analys av en stor population av nervceller inom en enda sektor av talamisk retikulära kärnan (TRN) hos makakapa. Dessa data är från en tidigare studie 7. Metoder för att selektivt märka TRN neuroner skjuter till rygg Lateral geniculate kärnan i thalamus (dLGN) med hjälp av kirurgisk injektion av modifierat rabiesvirus som kodar för EGFP 4, 8 (se tabell av specifika material / utrustning, rad 2) beskrivs. Denna modifierade rabiesvirus saknar den gen som kodar ett väsentligt höljesprotein, vilket eliminerar trans-synaptisk rörelsen av viruset. När viruset kommer in i axonet terminaler vid injektionsstället, fungerar den som en traditionell bakåtsträvande spårämne med viktig fördel med att köra EGFP uttryck genom hela dendritiska arborization av infekterade nervceller 5, 9, 10. Följaktligen kan denna G-deleted rabiesvirus användas för att selektivt infektera och märka någon neuronal population efter injektion och retrograd transport.
För att göra en analys av en specifik neuronal population, är det viktigt att ta prov frånen bred spridning av nervceller inom befolkningen. Eftersom viruset medierad märkningsteknik ger fullständig intracellulära "Golgi-liknande" fyller många neuroner med axoner på viruset injektionsstället, är det möjligt att rekonstruera en mycket stort urval av nervceller i den fulla omfattningen av en hjärnstruktur. Dessutom, eftersom den modifierade rabiesvirus är så effektiva på att infektera och märkning stort antal neuroner, är det möjligt att rekonstruera hundratals neuroner per djur. Förfaranden för provtagning 160 neuroner i hela den visuella delen av TRN 11 i syfte att alstra en omfattande prov av dLGN-utskjutande TRN neuroner beskrivs. Processen för att rekonstruera enskilda nervceller med hjälp av en neuron rekonstruktionssystem innefattande ett mikroskop, kamera, och återuppbyggnad mjukvara beskrivs. Vidare beskrivs metoder för att bestämma positionerna för enskilda nervceller i en hjärnstruktur (i det här fallet inom TRN) och för att kontrollera virusinjektion site och lokalisering i en struktur (i detta fall inom dLGN) med hjälp av volymkontur rekonstruktioner. Åtgärder för att exportera morfologiska data och utföra oberoende kluster analyser baserade på morfologiska mått mätt för varje neuron beskrivs. Det finns begränsningar för klustring metoder och det finns också en mängd olika klusteralgoritmer tillgängliga. Följaktligen är dessa alternativ och fördelarna med några av de mer vanligen använda algoritmer beskrivna. Klusteranalysen ger inte statistisk kontroll av det unika i kluster. Därför är ytterligare steg beskrivs att kontrollera optimal kluster samt relationerna mellan morfologiska data inom och mellan kluster. Statistiska metoder för att utvärdera kluster för TRN dataset för att bekräfta att TRN nervceller är grupperade i tre unika kluster baserat på 10 oberoende morfologiska mått beskrivs.
Således, genom att redogöra steg för att selektivt märkning, Rekonstruera och analysera morfologiska data från en specifik neuronal population, vi beskriver metoder för att kvantifiera morfologiska skillnader mellan nervceller i en population. Tidigare resultaten av distinkta neuronala typer inom den visuella delen av makakapa TRN bekräftas med separata metoder statistisk utvärdering. Tillsammans hoppas vi dessa tekniker kommer att vara i stort sett tillämpas på neuroanatomiska dataset och bidra till att fastställa kvantitativ klassificering av mångfalden av neuronala populationer genom hjärnan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuroanatomiska studier har förblivit en pelare av neurovetenskap och nyligen intresse connectomics och struktur-funktionssamband har förnyat entusiasm för detaljerad morfologisk karakterisering av selektiva neuronala populationer. Traditionellt har neuroanatomiska studier förlitat sig på kvalitativa klassificeringar av nervceller i morfologiskt distinkta klasser av nervceller som definieras av expert neuroanatomists. Med framsteg inom tekniker för att rekonstruera neuroner och extrahera morfologiska uppgifter, ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr.. Ed Callaway och Marty Usrey för att tillåta oss att använda vävnad framställd som en del av en tidigare studie och Libby Fairless och Shiyuan Liu för att få hjälp med neuronala rekonstruktioner. Detta arbete har finansierats av NIH (NEI: EY018683) och Whitehall Foundation.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y. . Histologie du systeme nerveaux de l’homme et des vertebres. , (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family?. Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
