Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
Skeletmuskler er sammensat af myofibre, de største celler i det mammale legeme og et af de få syncytia. Hvordan de komplekse og evolutionært bevarede strukturer, som udgør det samles stadig under efterforskning. Deres størrelse og fysiologiske funktioner ofte begrænser manipulation og billedbehandlingsprogrammer. Den kultur af immortaliserede cellelinjer er meget udbredt, men det kan kun replikere de tidlige trin af differentiering.
Her beskriver vi en protokol, der gør det nemt genetisk manipulation af myofibre oprindelse fra primære mus myoblaster. Efter en uges differentiering, de myofibre vise kontraktilitet, justeret sarkomerer og triader, samt perifere kerner. Hele differentiering proces kan efterfølges af direkte billedvisning eller immunofluorescens. Dette system kombinerer fordelene ved de eksisterende ex vivo og in vitro-protokoller. Muligheden for nem og effektiv transfektion samtden lette adgang til alle differentieringstrin udvider anvendelsesmulighederne. Myofibre efterfølgende kan anvendes ikke alene at tilgodese relevante udviklingsmæssige og cellebiologiske spørgsmål, men også at gengive muskel sygdomsfænotyper til kliniske anvendelser.
Skeletmuskel komponerer op til 40% af den menneskelige kropsvægt 1. Muskel-associerede sygdomme udgør en enorm sundhedsmæssige og økonomiske byrder 2. Hvordan dette meget komplekse og organiseret væv dannes, vedligeholdes, og regenereres udgør en omfattende og veletableret forskningsfelt. Afhængigt af den specifikke videnskabelig interesse, kan den mest velegnede metode spænder fra simple myotube kulturer til komplekse in vivo modeller 3 – 6.
Målet med denne protokol er at give et in vitro system, der giver mulighed for overvågning af myogenese via live billedbehandling og immunofluorescens. Sammenlignet med traditionelle fremgangsmåder, har en sådan meget komplet og dynamisk indsigt i musen myogene proces. Celler kan følges fra myoblast fase til den modne, flerkernede myofiber udviser tværgående triader og perifere kerner 7. Denne modning niveau kanopnås ved anvendelse af regelmæssig cellekultur udstyr, uden behov for komplekse stimulatoriske eller mekaniske apparater. Selv om nogle vellykkede in vitro-systemer er blevet rapporteret 8,9, så vidt vi ved, er dette den eneste protokol generere modne muse myofibre med T-tubuli tværs parret med reticulum (SR). Dette kan således in vitro system anvendes til at studere de molekylære mekanismer i triade formation, som stadig dårligt forståede 10.
En yderligere fordel ved at anvende dette system er tilgængeligheden af validerede muse-målrettede midler, såsom antistoffer, lægemidler og RNAi værktøjer. Den relativt simpel protokol kræver ikke besværlige trin, højtuddannede manipulation eller dyrt og dedikeret udstyr. Modnet myofibre blive vist efter 5 d kultur differentiering 7, viser kontraktilitet kombineret med calcium gnister (upublicerede data). På en uge, den anden udviklingal stadier af en af de mest komplekse celler i det mammale legeme kan studeres i kombination med en række forskellige in vitro assays.
Brugen af denne protokol til dyrkning af primære myoblaster giver anledning til en særlig niche, der i høj grad nærer udviklingen af myofibre. Dette skyldes delvis andre celletyper, der også er til stede i meget mindre mængder. skal opnås en balance mellem myoblast koncentration og kultur renhed. En god cellekultur afhænger også af kvaliteten af de produkter, der anvendes til mediet formulering. Alle produkter af animalske kilder bør gennemtestet. Det er vores erfaring, bør også overvåges fordøjelsen betingelser.
Som sædvanlig for primære kulturer, kan eksperimentel variabilitet være højere end i studier med isolerede fibre eller udødeliggjort myoblaster. Denne variabilitet kan mindskes ved standardisering af mellemstore og fordøjelse komponenter, mus alder og størrelse samt de tidspunkter for kultur manipulation og resultater kollektion. Alligevel den fordel gennemgangen i realtid de indviklede mekanismernødvendige for myofiber udvikling i høj grad overgår variabiliteten ulempe.
Denne protokol giver fordelene ved in vitro-metoder uden at kompromittere celledifferentiering. Myofibre modnes indtil triader dannes og sammentrækninger er koblet til calcium gnister. Disse funktionelle udgange kan tilgås på forskellige eksperimentelle betingelser. Desuden kan der være mange tekniske aendringer i protokollen. Myoblaster kan høstes fra neonatale mus med mutationer af interesse vedrørende muskel udvikling. Celler kan lyseres til biokemisk analyse på forskellige differentiering tidspunkter. Calcium indikatorer kan tilsættes til kulturen til at følge dens dynamik. Optogenetic konstruktioner kan anvendes til at håndhæve visse signalveje eller at inducere specifikke lokale reaktioner. Endelig kan myofibre blive dyrket sammen med andre celletyper til at studere deres samspil.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Dispase II | Gibco | 17105041 | |
Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions and Media | |||
Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |