Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
Muskler består av myofibers, de största cellerna i däggdjurskroppen och en av de få syncytia. Hur komplexa och evolutionärt konserverade strukturer som utgör den monteras fortfarande under utredning. Deras storlek och fysiologiska funktioner begränsar ofta manipulation och bildprogram. Den kultur av odödliggjorda cellinjer är allmänt används, men den kan bara replikera de tidiga stegen av differentiering.
Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör enkel genetisk manipulation av myofibers härrör från primära mus myoblaster. Efter en vecka av differentiering, de myofibers visa kontraktilitet, inriktade sarkomerer och triader, samt perifera kärnor. Hela differentieringsprocess kan följas av levande avbildning eller immunofluorescens. Detta system kombinerar fördelarna med den existerande ex vivo och in vitro-protokollen. Möjligheten till enkel och effektiv transfektion samtlättillgänglighet till alla differentieringssteg breddar potentiella tillämpningar. Myofibers kan därefter användas inte bara för att ta itu med relevanta utvecklings- och cellbiologiska frågor, men också för att reproducera muskelsjukdom fenotyper för kliniska tillämpningar.
Skelettmuskel komponerar upp till 40% av den mänskliga kroppen vikt 1. Muskelrelaterade besvär utgör en enorm hälsa och ekonomisk börda 2. Hur detta mycket komplexa och organiserad vävnad bildas, underhållas och regener utgör ett omfattande och väletablerat forskningsområde. Beroende på den specifika vetenskapligt intresse, kan den mest lämpade tillvägagångssättet varierar från enkla myotube kulturer till komplexa in vivo-modeller 3 – 6.
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett in vitro-system som gör det möjligt att övervaka myogenes genom levande avbildning och immunofluorescens. Jämfört med traditionella metoder, erbjuder detta system en mycket komplett och dynamisk insikt i musen myogenic processen. Celler kan följas från myoblast stadiet till den mogna, flerkärniga myofiber visar tvär triader och perifera kärnor 7. Denna mognad nivå kanuppnås med användning av vanlig cellodlingsutrustning, utan behov av komplexa stimulatoriska eller mekaniska anordningar. Även om en del framgångsrika in vitro-system har rapporterats 8,9, så vitt vi vet, är detta det enda protokollet att generera mogna mus myofibers med T-tubuli tvären parade med sarkoplasmatiska retiklet (SR). Således kan detta in vitro-system användas för att studera de molekylära mekanismerna för triad bildning, som fortfarande är dåligt förstådda 10.
En ytterligare fördel med att använda detta system är att det finns validerade mus riktade resurser, såsom antikroppar, läkemedel och RNAi verktyg. Den relativt enkelt protokoll kräver inte mödosamma steg, högutbildade manipulation, eller dyrt och dedikerad utrustning. Förfallna myofibers börjar visas efter 5 d kultur differentiering 7, visar kontraktilitet i kombination med kalcium gnistor (opublicerade data). I en vecka, de olika utvecklingal stadier av en av de mest komplexa celler i däggdjurskroppen kan studeras i kombination med en mängd olika in vitro-analyser.
Användningen av detta protokoll för odling av primära myoblaster ger upphov till en speciell nisch som kraftigt vårdar utvecklingen av myofibers. Detta beror delvis på andra celltyper som också är närvarande i mycket litet antal. En balans mellan myoblast koncentration och odlingsrenhet måste uppnås. En bra cellodling beror också på kvaliteten på de produkter som används för mediumformulering. Alla produkter som härrör från animaliska källor bör noggrant testade. I vår erfarenhet, bör matsmältningen villkor också övervakas.
Som vanligt för primära kulturer kan experimentell variabilitet vara högre än i studier med isolerade fibrer eller immortaliserade myoblaster. Denna variation kan minskas genom standardisering av medelstora och matsmältning komponenter, möss ålder och storlek, och tidpunkter för kultur manipulation och resultat samling. Icke desto mindre, den fördelen att granska i realtid de invecklade mekanismernödvändig för myofiber utveckling kraftigt överträffar variabiliteten nackdel.
Detta protokoll ger fördelarna med in vitro-metoder utan att kompromissa med celldifferentiering. Myofibers mogna tills triader bildas och sammandragningar är kopplade till kalcium gnistor. Dessa funktionella utgångar kan nås i olika experimentella förhållanden. Dessutom kan det finnas många tekniska variationer som gjorts i protokollet. Myoblaster kan skördas från neonatala möss med mutationer av intresse i samband med muskelutveckling. Celler kan lyseras för biokemisk analys vid olika differentierings tidpunkter. Kalciumindikatorer kan tillsättas till odlingen för att följa dess dynamik. Optogenetic konstruktioner kan användas för att genomdriva vissa signalvägar eller att inducera specifika lokala reaktioner. Slutligen kan de myofibers vara samodlades med andra celltyper för att studera deras interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Dispase II | Gibco | 17105041 | |
Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions and Media | |||
Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |