Levende confocal bildebehandling gir biologer med et kraftig verktøy for å studere utvikling. Her presenterer vi en detaljert protokoll for live confocal bildebehandling for å utvikle Arabidopsis blomster.
Studiet av plantevekst og utvikling har lenge vært avhengig av eksperimentelle teknikker ved bruk av døde, faste vev og uten tilstrekkelig cellulær oppløsning. Nylige fremskritt innen konfokal mikroskopi, kombinert med utviklingen av en rekke fluoroforer, har overvinne disse problemene og åpnet muligheten for å studere ekspresjonen av flere gener samtidig, med en god cellulær oppløsning, i levende prøver. Levende konfokal avbildning gir plante biologer med et kraftig verktøy for å studere utviklingen, og har vært mye brukt for å studere rotvekst og dannelsen av laterale organer på flankene av den shoot apikale meristem. Men det har ikke vært mye brukt til studiet av blomst utvikling, delvis på grunn av utfordringer som er spesifikke for bildebehandling blomster, for eksempel begerbladene som vokser over blomsten meristem, og filtrere ut fluorescens fra underliggende vev. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å opptre live confocal bildebehandling på live, utvikle Arabidopsis blomsterknopper, ved hjelp av enten en oppreist eller en invertert mikroskop.
Mesteparten av plantekroppen danner etter embryonically fra grupper av stamceller som ligger ved eller nær tuppen – eller apikale meristem – av skuddene og røttene. Alle over bakken strukturer av voksen plante utlede fra de skyter apikale meristem (SAM), som kontinuerlig frembringer siderettede organer på sine flanker: blader under den vegetative fase, og blomster meristemer (FMS) etter at den overganger til den reproduktive fase. FMS i sin tur utvikle seg til blomster. Mens Arabidopsis SAM frembringer siderettede organer, ett om gangen, i en iterativ, spiralmønster, FMS produsere fire typer blomster organer i fire kranser, i en delvis synkron måte, med flere utviklingsmessige programmer rakne samtidig. De genetiske nettverk underliggende spesifikasjon av identiteten til de ulike blomster organer har blitt delvis påvist (for vurderinger, se referanser 1, 2), men mange aspekter av blomst utviklnt, slik som blomster organ posisjonering og definisjon av grensene mellom spinnehjul, fremdeles er lite forstått.
Tidlige molekylærgenetiske studier av planteutvikling for det meste avhengig av teknikker så som in situ hybridisering og GUS-pressen for å analysere genekspresjon. Selv om disse metodene har gitt et vell av informasjon og i stor grad bidratt til vår forståelse av plantevekst og blomst utvikling, det er viktige begrensninger: de mangler god mobil oppløsning, ikke tillate for enkel observasjon av uttrykket mønster av flere gener i samme prøver, og viktigere, kan bare brukes på døde, faste vev. Nylige fremskritt innen konfokalmikroskopi har overvinne disse begrensningene, og gi utviklings biologer med et kraftig verktøy for å undersøke prosessene underliggende anlegg morphogenesis. Særlig gjør konfokal mikroskopi for observasjon av levende vev og organer i hele deres dannelse, som er critical å forstå en typiske dynamisk prosess som utvikling.
Levende konfokalt avbildnings har vært mye brukt for å analysere antennen vekst av planter og produksjonen av sideorganene av SAM (f.eks refererer 3, 4, 5, 6), men med unntak av noen få rapporter (f.eks referanser 7, 8, 9, 10), har det ikke blitt mye brukt til studiet av blomst utvikling. Protokoller for live confocal avbildning av SAM er tilgjengelig (f.eks refererer 11, 12), og gir et godt utgangspunkt for hvordan til bilde utviklingsblomsterknopper som omgir SAM. Men bildeblomsterknopper presenterer konkrete utfordringer: for eksempel,blomsterknopper raskt bli større enn SAM, og i trinn 4, begerbladene begynner å dekke FM (trinn som beskrevet i referanse 13), og dimming fluorescensen fra underliggende vev (figur 2A). Her gir vi en detaljert protokoll som forklarer hvordan å opptre live confocal bildebehandling på å utvikle Arabidopsis blomsterknopper ved hjelp av enten en oppreist eller en omvendt mikroskop og en vann-dipping objektiv. Vi har tidligere publisert denne protokollen i referanse 14.
Her gir vi en protokoll for avbildning av levende, utvikle Arabidopsis blomsterknopper med konfokal mikroskop og en vann-dipping objektiv. Selv om dette kan gjøres med enten stående eller en omvendt mikroskop, er det enklere og raskere å bruke det tidligere. Det er også verdt å merke seg at forskjellige konfokale systemer varierer betraktelig når det gjelder hastighet, følsomhet og evne til å skille bølgelengder. De beste konfokale mikroskop nå la det bilde flere ulike kanaler (f.eks GFP, YFP, DsRed og propidium-jodid; figur 2G) i de samme prøvene. Noen konfokale mikroskop er utstyrt med en spektral-detektor, som kan samle fluorescensen fra flere fluoroforer samtidig og skille dem etterpå. Ved bruk av en vanlig detektor, men et sett av lasere og filtre må brukes for å eksitere og skille fluorescens fra forskjellige fluoroforer. Noen fluoroforer ha fullt tydelig emisjonsspektra (f.eks CFP end YFP), og kan avbildes samtidig. Andre fluoroforer har delvis overlappende emisjonsspektra (f.eks GFP og YFP), og vanligvis må avbildes separat, noe som reduserer avbildnings tid. Imaging nære fluoroforer krever også ofte begrense hvor mye av den spektrum ble registrert for hver kanal for å hindre at fluorescensen fra en fluorofor fra å lekke inn i en annen kanal. Dette fører til et tap av intensiteten til det oppsamlede signal, noe som kan kompenseres ved en økning i lasereffekten og forsterkning. Imidlertid kan et forlenget avbildning tid og økt lasereffektblekemiddel og / eller skade på prøven. Økt lasereffekten og / eller forsterkning kan også øke bakgrunnsstøy. Optimalisering av signalintensitet, oppløsning og avbildning tid for hver prøve er gjort gjennom en prøve-og-feile-prosess, og involverer permanent avveininger.
Denne protokollen forklarer hvordan å opptre live confocal avbildning av blomsterknopper utviklings på flankene av en dissekert skyte apex. Denkan argumenteres for at det faktum at skuddtoppen ikke er koblet til resten av anlegget og vokser i et medium som inneholder cytokinins kan påvirke SAM og blomst utvikling. Men dette mediet er designet empirisk gjennom en prøve-og-feile-prosess for å sikre dissekert shoot apikale meristem produsere nye blomsterknopper på normal plastochron, og at disse blomsterknopper utvikle seg normalt 15. Tilsvarende betyr sepal disseksjon ikke ut til å påvirke genuttrykk mønstre eller utviklingen av resten av blomsten. Andre protokoller detalj hvordan man skal utføre direkte konfokal avbildning av SAM fremdeles er festet til resten av anlegget (f.eks referanse 11). Slike protokoller kan tilpasses til, og gi et nyttig alternativ for avbilding av utvikle blomster, særlig når man studerer cytokinin-relaterte prosesser. De presenterer derimot flere ulemper: spinde elongates og vendinger, og endrer orienteringen av blomsterknopper; ennd mens imaging en shoot apex festet til resten av anlegget fungerer godt med en oppreist mikroskop, er det mye mer komplisert å gjøre det med en invertert mikroskop.
Nedsenking linser har en bedre numeriske apertur (NA) enn "tørre" linser (dvs. linser som er adskilt fra prøven ved hjelp av luft), og derfor tilveiebringe en finere oppløsning av prøven, som er kritisk når det ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Ved hjelp av en vann-dipping linse således gir en mye bedre NA enn en tørr linse, samtidig som det hindrer skuddtoppen fra dehydrerende under avbildningsprosessen. Selv om glyserin og olje linser har en enda høyere NA enn vannglass, krever de anvendelse av et dekkglass, som er meget upraktisk med en prøve på størrelse med en skuddspiss, som også fortsetter å vokse i løpet av time-lapse eksperimenter. På grunn av størrelsen av prøvene (avhengig av blomster trinn, kan stabler være over 150 um tykk), er det også viktig å anvende en linse med en lang arbeidsavstand. Vi bruker vanligvis en 20 eller 40X objektiv med et NA av en og en arbeidsavstand på 1,7-2,5 mm.
Konfokalt mikroskop Programvaren har flere måter å visual konfokale data, inkludert tre-dimensjonale rekonstruksjoner (figur 2, B1, B2 og B4) og visninger stykke (figur 2, B3). Mens de mest brukte tre-dimensjonalt, er maksimumsintensitets projeksjoner av konfokale Z-stabler (figur 2, B1 og B4), noen programvare (f.eks zen og Imaris) har også utsikt transparens som filtrerer ut signalet fra de dypere deler av prøven (figur 2, B2) som kan være nyttig når man ser på prosesser som finner sted, eller gener uttrykt i, epidermal laget. Signalintensiteten kan enten være kodet med en enkelt farge (figur 2, B1), ved anvendelse av piksel intensity, eller ved hjelp av en fargekode (figur 2, B4).
Levende confocal bildebehandling tilbyr ikke bare verdifull kvalitative innsikt i blomst utvikling, det også potensielt gir utviklings biologer med et vell av kvantitative data. Forskjellige programvare (f.eks Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) gjør det mulig for kvantifisering av antallet eller volumet av celler som uttrykker en eller flere reportere, eller nivået av ekspresjon av et reportergen i forskjellige celler. Slik programvare kan også brukes til å utføre automatisk celle segmentering, spore cellelinjer og kvantifisere vekst. Dette annen programvare tilbyr lignende verktøy, men også skiller seg på mange måter. MARS-ALT og MorphoGraphX ble utviklet spesielt for planter 15, 20, 21, i motsetning til en Imarisnd Fiji. MorphoGraphX tillater bare for segmenteringen og analyse av den epidermale lag, mens Imaris og MARS-ALT tillate for segmentering og analyse av hele prøven. Imidlertid krever MARS-ALT den forutgående avbildning av den samme prøven fra tre forskjellige vinkler 15, og Imaris krever bare en enkelt stabel. Tilgang til kvantitativ informasjon er avgjørende for å videreutvikle vår forståelse av blomst utvikling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren ønsker å takke professor Elliot M. Meyerowitz for hans støtte og kommentarer til manuskriptet, samt Ann Lavanway ved Dartmouth College og Dr. Andres Collazo ved Biologisk Imaging Facility ved Caltech for deres hjelp i å løse tekniske problemer med levende confocal bildebehandling. Nathanaël Prunet arbeid er støttet av det amerikanske National Institutes of Health gjennom Grant R01 GM104244 til Elliot M. Meyerowitz.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |