Live konfokal avbildning ger biologer med ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för levande konfokal avbildning att utveckla Arabidopsis blommor.
Studiet av växternas tillväxt och utveckling har länge förlitat sig på experimentella tekniker med döda, fasta vävnader och saknar ordentlig cellulär upplösning. Senaste framstegen inom konfokalmikroskopi, i kombination med utvecklingen av ett stort antal fluoroforer har övervinna dessa frågor och öppnade möjligheten att studera uttrycket av flera gener samtidigt med en god cellulär upplösning i levande prover. Live konfokal avbildning ger växtbiologer med ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen, och har i stor utsträckning använts för att studera rottillväxt och bildandet av sido organ på flankerna av skott toppmeristem. Men det har inte varit i stor utsträckning för att studera blomma utveckling, delvis på grund av utmaningar som är specifika för avbildning blommor, såsom foderblad som växer över blomman meristem och filtrera bort fluorescens från underliggande vävnader. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att uppträda live konfokal avbildning på levande, utveckla Arabidopsis blomknoppar, med användning av antingen en upprätt eller ett inverterat mikroskop.
De flesta av anläggningen kroppen bildar post-embryonal från grupper av stamceller belägna vid eller nära spetsen – eller apikala meristem – av skott och rötter. Alla ovan jord strukturer av den vuxna växten härrör från inspelningen apikala meristem (SAM), som kontinuerligt producerar laterala organ på sina flanker: lämnar under den vegetativa fasen, och blom meristem (FMS) efter att den övergår till det reproduktiva fasen. FMs i sin tur utvecklas till blommor. Medan Arabidopsis SAM producerar laterala organ en i taget, på ett iterativt, spiralmönster, FMs producerar fyra typer av floral organ inom fyra virvlar, i ett delvis synkront sätt, med flera utvecklingsprogram unraveling samtidigt. De genetiska nätverk som ligger bakom specifikation av identiteten på de olika blomster organ har delvis dechiffreras (omdömen, se referenserna 1, 2), men många aspekter av blomma development, såsom blomorgan positionering och definitionen av gränserna mellan virvlar, dåligt förblir förstådd.
Tidiga molekylärgenetiska studier av växtutveckling förlitade sig främst på tekniker såsom in situ hybridisering och GUS reportrar för att analysera genuttryck. Även om dessa metoder har gett en mängd information och starkt bidragit till vår förståelse av växters tillväxt och blomma utveckling, det finns viktiga begränsningar: de saknar god cellulär upplösning, inte gör det möjligt att lätt observation av uttrycksmönstret av flera gener i samma prover, och viktigare, kan endast tillämpas på döda, fasta vävnader. Senaste framstegen inom konfokalmikroskopi har övervinna dessa begränsningar, och ge utvecklingsbiologer med ett kraftfullt verktyg för att undersöka processer som ligger bakom anläggningen morfogenes. I synnerhet tillåter konfokalmikroskopi för observation av levande vävnader och organ i hela sin formation, vilket är critical att till fullo förstå en genuint dynamisk process som utveckling.
Levande konfokal avbildning har i stor utsträckning använts för att analysera antenn tillväxt av växter och produktion av laterala organ genom SAM (t.ex. refererar 3, 4, 5, 6), men med undantag för ett fåtal rapporter (t.ex. referenserna 7, 8, 9, 10), det har inte varit i stor utsträckning för att studera blomma utveckling. Protokoll för levande konfokal avbildning av SAM finns (t.ex. referenser 11, 12), och ger en bra bas för hur bilden utvecklingsblomknoppar som omger SAM. Men bildblomknoppar innebär särskilda utmaningar: till exempel,blomknoppar blir snabbt större än SAM, och i skede 4, foderblad börja täcker FM (stadier såsom beskrives i referens 13), och ljusreglering fluorescensen från underliggande vävnader (Figur 2A). Här ger vi ett detaljerat protokoll som förklarar hur man uppträda live konfokal avbildning på att utveckla Arabidopsis blomknoppar med antingen en upprätt eller inverterat mikroskop och en vattendoppning lins. Vi har tidigare publicerat detta protokoll i 14 referens.
Här ger vi ett protokoll för avbildning av levande, utveckla Arabidopsis blomknoppar med ett konfokalmikroskop och en vattendoppning lins. Även om detta kan göras med antingen en upprätt eller inverterat mikroskop, är det lättare och snabbare att använda den förstnämnda. Det är också värt att notera att olika konfokala system varierar kraftigt när det gäller snabbhet, känslighet och förmåga att separera våglängder. De bästa konfokala mikroskop tillåter nu att avbilda flera olika kanaler (t.ex. GFP, YFP, dsRed och propidiumjodid; Figur 2G) i samma prover. Vissa konfokala mikroskop är utrustade med en spektral detektor, som kan samla fluorescensen från flera fluoroforer samtidigt och separera dem efteråt. Vid användning av en vanlig detektor, dock en uppsättning av lasrar och filter måste användas för att excitera och separera fluorescens från olika fluoroforer. Vissa fluoroforer har helt distinkta emissionsspektra (t.ex. GFP end YFP), och kan avbildas samtidigt. Andra fluoroforer har delvis överlappande emissionsspektra (t.ex. GFP och YFP), och vanligtvis måste avbildas separat, vilket ökar avbildningstiden. Avbildning close fluoroforer också kräver ofta att begränsa hur mycket av spektrumet samlas in för varje kanal för att förhindra fluorescens från en fluorofor från att läcka in i en annan kanal. Detta orsakar en förlust av intensitet av det insamlade signalen, vilket kan kompenseras genom en ökning av lasereffekt och förstärkningen. Emellertid kan förlängd imaging tid och ökad lasereffekt bleka och / eller skada provet. Ökad lasereffekt och / eller förstärkning kan också öka bakgrundsbruset. Optimering av signalintensitet, upplösning och avbildningstiden för varje prov görs genom en trial-and-error process, och involverar permanenta kompromisser.
Detta protokoll förklarar hur man spela live konfokal avbildning av blomknoppar utvecklas på sidorna av en dissekerade skott apex. Detkan hävdas att det faktum att skjuta spetsen inte är ansluten till resten av anläggningen och växer i ett medium som innehåller cytokininer skulle kunna påverka SAM och blomma utveckling. Emellertid var detta medium utformad empiriskt genom trial-and-error process för att säkerställa dissekerade skjuta apikala meristem producera nya blomknoppar vid normal plastochron, och att dessa blomknoppar utvecklas normalt 15. Inte heller sepal dissektion verkar inte påverka genuttryck mönster eller utvecklingen i resten av blomman. Andra protokoll specificerar hur man utför levande konfokal avbildning av SAM fortfarande är fäst till resten av anläggningen (t.ex. 11 referens). Sådana protokoll skulle kunna anpassas till, och erbjuda ett användbart alternativ för avbildning av att utveckla blommor, speciellt när man studerar cytokininglukuronider relaterade processer. De presenterar flera nackdelar dock: stammen förlängs och vändningar, och ändrar inriktningen av blomknoppar; ennd medan avbildning ett skott apex fäst till resten av anläggningen fungerar bra med en upprätt mikroskop, är det mycket mer komplicerat att göra det med ett inverterat mikroskop.
Dopp linser har en bättre numerisk apertur (NA) än "torra" linser (dvs. linser som är separerade från provet genom luft), och ger därmed en finare upplösning av provet, vilket är kritiskt när man använder ett konfokalt mikroskop. Med användning av en vatten-doppning lins tillhandahåller således en mycket bättre NA än en torr lins, samtidigt förhindra skott apex från dehydratisering under avbildningsprocessen. Medan glycerin och olje linser har en ännu högre NA än vatten linser, de kräver användning av ett täck, vilket är mycket opraktiskt med ett prov storleken på ett skott apex, som också fortsätter att växa under tidsförlopp experiment. Med tanke på storleken av proverna (beroende på blom steg, kan staplarna vara över 150 ^ m tjock), är det också viktigt att använda en lins med en lång arbetsavstånd. Vi använder typiskt en 20 eller 40X objektiv med ett NA på 1 och ett arbetsavstånd av 1,7-2,5 mm.
Konfokalmikroskop mjukvara erbjuder flera sätt att visualisera konfokala data, inklusive tredimensionella rekonstruktioner (Figur 2, B1, B2 och B4) och vyer slice (Figur 2, B3). Medan de mest vanligen använda tredimensionella vyer är maximala intensitets projektioner av de konfokala Z-stackar (Figur 2, B1 och B4), vissa program (t.ex. ZEN och Imaris) erbjuder också utsikt transparens som filtrerar bort signalen från de djupare delarna av provet (Figur 2, B2), vilket kan vara användbart när man tittar på processer som äger rum, eller gener som uttrycks i, det epidermala skiktet. Signalintensiteten kan antingen kodas med en enda färg (Figur 2, B1), med användning av pixel integrensity, eller med användning av en färgkod (Figur 2, B4).
Live konfokal avbildning erbjuder inte bara värdefulla kvalitativa insikter blomma utveckling, potentiellt ger också utvecklingsbiologer med en mängd kvantitativa data. Annorlunda mjukvara (t.ex. Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) möjliggör för kvantifiering av antalet eller volymen av celler som uttrycker en eller flera reportrar eller nivån av uttryck av en rapportörgen i olika celler. Sådan programvara kan också användas för att utföra automatisk cell segmentering, spåra cellhärkomster och kvantifiera tillväxt. Denna annorlunda mjukvara erbjuder liknande verktyg, men också skiljer sig på många sätt. MARS-ALT och MorphoGraphX utformades specifikt för växter 15, 20, 21, till skillnad från Imaris ennd Fiji. MorphoGraphX tillåter endast för segmentering och analys av epidermal lagret, medan Imaris och MARS-ALT möjliggöra segmentering och analys av hela provet. Kräver emellertid MARS-ALT den tidigare avbildning av samma prov från tre olika vinklar 15, och Imaris kräver endast en enda stack. Tillgång till kvantitativ information är avgörande för att främja vår förståelse av blomutveckling.
The authors have nothing to disclose.
Författaren vill tacka professor Elliot M. Meyerowitz för hans stöd och synpunkter på manuskriptet samt Ann Lavanway på Dartmouth College och Dr Andres Collazo på biologisk avbildning Facility vid Caltech för deras hjälp med att lösa tekniska problem med levande konfokal avbildning. Nathanaël Prunet arbete stöds av amerikanska National Institutes of Health genom Grant R01 GM104244 till Elliot M. Meyerowitz.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |