Protokoll for Microplastics Prøvetaking på havoverflaten og Sample Analysis

Summary

Protokollen nedenfor beskriver metodologien for: microplastics prøvetaking på havoverflaten, separasjon av mikroplast og kjemisk identifisering av partikler. Denne protokollen er i tråd med anbefalingene for microplastics overvåking utgitt av MSFD Teknisk undergruppe på marin forsøpling.

Abstract

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an »A frame« attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

Introduction

Microplastic pollution in the sea represents a growing concern to contemporary society, due to the constant increase in plastic production and its subsequent disposal and accumulation in the marine environment¹. Even if plastic macro litter would no longer enter the seas, microplastic pollution would continue to grow due to fragmentation of already existing plastic litter in the sea². The majority of microplastic pollution studies were carried out in marine and fresh water ecosystems and mainly addressed sea surface pollution³.

The term microplastic refers to plastic particles smaller than 5 mm in size⁴. This term describes a heterogeneous mixture of particles, which can differ in size (from a few microns to several millimeters), color and shape (from very different shapes of fragments to long fibers). Microplastic particles can be of a primary or secondary origin⁵. Microplastic of primary origin is manufactured as small particles used in the cosmetics industry (pilling crème etc.) or chemical industry as precursor for other plastic products (e.g. plastic pellets used in plastic industry). Microplastic of secondary origin arise via the degradation of larger plastic pieces in the environment due to physical and chemical processes, induced by light, heat, oxygen, water and organisms⁶. In 2015, four types of microplastic sources were defined: larger plastic litter, cleaning products, medicines and textiles⁶. The main source (80 %) of larger plastic litter is assumed to be land based⁷. Microplastic from cosmetic products, medicines and textile enters water ecosystems through sewage and storm waters⁶. Microplastic particles most frequently found in water ecosystems are fragments from larger plastic litter and textile fibers⁸.

Microplastics have several negative effects on the environment. Their small size allows them to enter the food web through ingestion by marine organisms^{9, 10}. Ingested particles can cause physical damage or block the digestive system of animals¹¹. Particles can also be carriers of persistent organic pollutants (POPs). Their hydrophobic surface and favorable ratio of large surface area to small volume, enables POPs to adsorb onto the microplastics¹². In the environment or digestive systems of animals who ingest them, POPs and other plastic additives can be leached from microplastic particles¹³.

Previous studies reported the ubiquitous presence of microplastics in the marine environment³, from the water column to the bottom sediments. The threat of microplastic pollution was already identified by the Marine Strategy Framework Directive in the EU and, consequently, mandatory monitoring of microplastics was advised¹⁴. Accordingly, the EU Technical Subgroup on Marine Litter (TSG-ML) prepared recommendations for monitoring of microplastics in the European seas¹⁵. Thus, the video guidelines for microplastics sampling are of high importance, as they support comparative monitoring and a coherent management process all over the world.

This protocol was developed within the DeFishGear project for the first monitoring of microplastic pollution in the Adriatic Sea. Recommendations from the document “Guidance on Monitoring of Marine Litter in European Seas” by TSG-ML¹⁵ were taken into account. This protocol describes the methodology for microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastics from the samples, and chemical analysis of microplastic particles to confirm that particles are from plastic material and to identify the type of plastic. Sampling was done by the use of a manta net, which is the most suitable equipment for sampling in calm waters¹⁶. Separation of microplastics from the samples was carried out by visual identification using a stereomicroscope. Isolated particles were later chemically identified using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and micro FTIR spectroscopy.

Protocol

1. Prøvetaking av microplastics på havoverflaten Distribuere manta nettet fra siden av fartøyet ved hjelp av en spinnakerbom eller »A-frame« ved hjelp av linjer og karabinkroker. Distribuere manta netto ut av kjølvannet sone (ca 3 -. 4 m avstand fra båten) for å hindre oppsamling vann påvirket av turbulens i kjølvannet sone. Skriv ned de første GPS-koordinater og første gang i databladet. Begynn å bevege seg i en rett retning med en hastighet på ca.. 2 – 3 knop i 30 minutter og begynner målingen av tiden. Etter 30 min stoppe båten og skrive ned siste GPS-koordinater, lengden på ruten (den mest korrekte måten er å beregne lengden fra GPS-koordinater) og gjennomsnittlig båtens fart inn i databladet gitt og løft manta netto ut av vannet. Skyll manta netto grundig fra utsiden av nettet med sjøvann ved hjelp av en nedsenkbar pumpe eller vann fra båten water reservoaret. Skyll i retning fra manta munnen til sekken for å konsentrere alle partikler festet til nettet i sekken. Merk: Skyll aldri prøven gjennom åpningen av nettet, for å hindre forurensning. Trygg fjerning av sekken og sil prøven i sekken gjennom en 300 mikrometer maskevidde sil eller mindre. Skyll grundig sekken fra utsiden, og helle resten av prøven gjennom sikten. Gjenta dette trinnet til det ikke lenger er noen partikler inni sekken. Konsentrer alt materiale på sikten i en del av sikten. Med bruk av en trakt, skyll sil inn i en glasskrukke eller plastflaske ved å bruke 70% etanol. Lukk flasken, tørk den med tørkepapir og merke lokket og utsiden av glasset med prøven navn og dato med vannfast tusj (du bør også sette en annen etikett skrevet med blyant på velum papir i en krukke for å unngå mulig tap avprøven navn på grunn av den slettede etiketten på glasset). Overfør merket plastflaske inn i kjøleboks. Merknad til generelle prøvetakingsforhold: Vindhastigheten bør ikke være mer enn to Beaufort, siden bølgene er for høye, og nettet er ikke stabil på havoverflaten. Det er viktig å opprettholde en jevn lineær kurs med konstant hastighet i løpet av trål. Halvparten av manta netto åpning bør bli senket under prøvetaking. Varigheten av sampling bør være 30 min (i tilfeller hvor det er en stor mengde naturlig materiale, for eksempel plankton blomst, kan varigheten av sampling være kortere). Unngå bruk av plast verktøy og containere. Unngå syntetiske klær (f.eks fleece), til tau og kontakt manta nett med fartøyet unngå kontaminering av prøven. Vær veldig forsiktig så du ikke skader manta nettet eller båtskroget mens distribusjon og fange nettet. 2. Separering av microplastics fra havoverflaten prøvene Dersom prøven ikke inneholdernoen elementer som er større enn 25 mm og ser ut til å være ren, fortsette direkte med trinn 3. Hell prøven gjennom (mikrometer maskevidde ≤300) sikten og fjerne alle naturlige eller kunstige søppel objekter av en størrelse> 5 mm (makro og mezzo søppel) fra prøven, ved hjelp av visuell identifisering og pinsett. Vær nøye med å skylle hvert fjernet objekt nøye med destillert vann for å fjerne eventuelle mikroplast søppel overholdt den. Oppbevar alle naturlige og kunstige søppel objekter i egne beholdere. Tørk alle naturlige og kunstige søppel objekter i et tørke (eller i friluft, men i en lukket rett) og veie dem. Identifisere alle søppelgjenstander> 25 mm (makro kull) i henhold til Master Liste over kategorier av Søppel elementer 16. Etter å ha fjernet alle større gjenstander, konsentrere alle gjenværende brikker i en del av sikten ved hjelp sprut flasker eller vann fra springen. Helle prøven i en glassbeholder ved hjelp av et minimum av 70% etanol ved hjelp av et funnel. Merk: I dette trinnet er avgjørende ved bruk av 70% etanol for å bevare prøven. Også på trinnet for visuell inspeksjon av prøven, etanol bidrar til å misfarge organismer og fargerike plast derfor bli lettere å finne. Ta en liten mengde av prøven (subsample) og hell den i et glass petriskål. Analysere prøven ved bruk av et stereomikroskop (20 – 80x zoom) og søk etter mikropartikler. Hver mikroplast partikkel bør kategoriseres i en av kategoriene som er oppført i tabell 1 og satt i en petriskål eller andre glassflasker, merket med et kategorinavn. Petriskål må være lukket til enhver tid. Merk: Når skille microplastics fra prøven være konservativ og velge mer heller enn mindre partikler for analyse. Den virkelige kjemiske struktur av partikler vil fortsatt bli bestemt senere. Sørg for å analysere større gjenstander fra alle kanter når microplastics kan bli sittende fast og derfor skjult under større elementer.Det kan også være nyttig til å bevege seg allerede analysert gjenstander til den ene side av petriskålen. Sett petriskål under mikroskop med måleutstyr (okulær hersker kalibrert ved mikrometer lysbilde eller bildeanalyse programvare) og måle størrelsen på hver partikkel (måle den lengste diagonal), med unntak av filamenter, og merk fargen. Hver subsample bør gjennomgås av en annen person. Vær nøye med å skylle glassbeholderen utvalget slik at alle partikler fester seg til glassveggene er vasket i petriskål. Veie mikropartiklene i hver kategori for seg ved bruk av analytisk skala. Mikropartikler må tørkes før veiing. Den lukkede petriskål kan settes i et tørke eller prøvene kan stå til tørk i et lukket rett til partikler ble tørr (vekten av lukkede petriskål med partikler er konstant). Identifisere mikro kull. Når analysere en prøve på jakt etter microplastics, kan du vurdere detnoen partikler vil være lett synlig (farge, form, størrelse), mens andre kan være vanskeligere å finne. Nedenfor er noen funksjoner som identifiserer mikropartikler i prøven: For eksempel ingen cellestruktur, ujevn, skarpe, skjeve kanter, jevn tykkelse, karakteristiske farger (blå, grønn, gul, etc.). 3. Kjemisk identifikasjon av microplastics ATR-FTIR-spektroskopi Før analysen rengjøre deteksjonssystem med alkohol og en lofri klut. Spill en bakgrunn spektrum. Plasser prøven på prøveholderen og samle spektra. Identifisere den oppnådde ATR- FTIR-spektra ved bruk av en automatisert sammenligning av det oppnådde spektrum med spektra i en database. Micro ATR-FTIR-spektroskopi Før analysen rengjøre deteksjonssystem med alkohol og en lofri klut. Plasser prøven på et glassfilter. Merk: Andre filtre kan være ossed men deres polymer natur kan påvirke karakterisering. Plasser filteret med prøven på automatisk skanning bordet og bruke styrespaken til å finne prøven. Spill et optisk bilde og markere et område (f.eks 20 av 20 mikrometer) hvor prøven vil være preget. Spill en bakgrunn spektrum. Plasser prøven på prøveholderen og samle spektra ved forhåndsdefinerte sted. Identifisere den oppnådde mikro ATR-FTIR-spektra ved bruk av en automatisert sammenligning av det oppnådde spektrum med spektra i en database.

Representative Results

Det første resultatet av den beskrevne protokollen er mikropartikler kategorisert i seks kategorier i henhold til deres visuelle funksjoner (tabell 1). Den første kategori, og vanligvis er den mest tallrike en, er fragmenter (figur 1). De er stive, tykke, med skarpe skjeve kanter og en uregelmessig form. De kan være i en rekke forskjellige farger. Den andre kategorien er filmer (figur 2). De vises også i uregelmessig form, men sammenlignet med fragmenter, de er tynne og fleksible og vanligvis gjennomsiktig. Den tredje kategori er pellets (figur 3), vanligvis stammer fra plastindustrien. De er uregelmessige, runde former, og normalt større i størrelse, omtrent 5 mm i diameter. De er vanligvis flat på den ene side, og kan være av forskjellige farger. Den fjerde kategorien er granulater (figur 4). I sammenligning med pellets, har de en vanlig rund form og vanligvis en mindre størrelse, omkring 1 mm i diameter. De vises i naturlige farger(Hvit, beige, brunt). Den femte kategorien er filamenter (figur 5). De er, ved siden av fragmenter, den mest vanlige typen av mikropartikler. De kan være korte eller lange, med forskjellige tykkelser og farger. Den siste kategori er skum (figur 6). De kommer oftest fra store partikler av styrofoam. De er en myk, uregelmessig form og hvit til gul i farge. Det viktigste resultat av microplastics prøvetaking og analyse av prøver er antall mikropartikler per prøve. Disse dataene kan være ytterligere normalisert per km 2. Formelen som brukes for normalisering er: mikropartikler per prøve / prøveareal, hvor prøvetakingsområdet beregnes ved å multiplisere sampling avstand av bredden av åpningen av manta nettet (tabellene 2, 3; figur 7). I tillegg kan partiklene bli analysert med imalder analyse programvare. Resultatene er maksimal lengde og rundt hver partikkel (tabell 4). Figur 8a viser partikler før bildeanalyse og figur 8b er etter bildeanalyse, hvor hver partikkel måles og nummerert. Endelig anbefales en kjemisk analyse av det totale eller høyest mulig antall partikler per prøve. Ved hjelp av Fourier transform infrarød spektroskopi et spektrum av den valgte partikkel er ervervet, som vist på figur 9. Denne spektrum blir så sammenlignet med spektrene fra programvarebiblioteket (figur 10). Det endelige resultatet vil vise om en gitt partikkel er av plast eller ikke, og angi hva slags plast fra den kjemiske strukturen. 1 fragmenter 2 Films 3 pellets 4 granulat 5 filamenter 6 skum s Tabell 1: Kategorier av mikropartikler. Figur 1: Eksempel på partikler fra kategori: Fragments. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: Eksempel på partikler fra kategori: Films. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. /55161fig3.jpg "/> Figur 3: Eksempel på partikler innen kategorien: Pellets. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: Eksempel på partikler fra kategori: Granulat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5: Eksempel på partikler fra kategori: filamenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 6: Eksempel på partikler innen kategorien: Skum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Prøvetaking avstand [km] 2 Manta bredde [km] 0,0006 Prøvetaking området [km 2] 0,0012 Tabell 2: Eksempel på data fra undersøkelsen, som brukes for beregning av mikropartikler per km 2. Nei Nei / km 2 fragmenter 301 250833 filmer 45 37500 pellets 15 12500 granulater 8 6667 skum 33 27500 filamenter 223 185833 Tabell 3: Eksempel på resultater fra undersøkelsen, hvor de kategoriserte data inn i 6 grupper telles og normalisert per km 2 (Nei – antall partikler). Figur 7: Eksempel på representative resultater etter visuell kategorisering av partikler (Nei – antall partikler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Index Region Areal [mm²] Maksimal lengde [mm] 1 8,010 5,506 2 10,517 5,628 3 12,185 5,429 4 3,367 3,367 5 2,475 2,155 6 1,809 2,943 7 6,604 5,238 8 5,779 4,037 9 4,472 3,791 10 16,907 5,355 11 7,246 3,733 12 7,867 4,622 1. 3 6,411 5,056 14 3,281 3.070 15 12,937 5,554 16 6,709 3,716 Tabell 4: Eksempel på bildeanalyseresultater der område [mm 2] og maksimal lengde [mm] av hver partikkel måles. Figur 8: Eksempel på bilde ervervet a) før og b) etter bildeanalyse av partikler med bildeanalyse programvare.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 9: Eksempel på en spektra målt på et valgt partikkel med merkede toppene og deres bølgelengder [cm -1]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 10: Eksempel på sammenligning av ervervet spektra fra valgt partikkel til beste kamp fra ATR-FTIR spektra bibliotek. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Discussion

Microplastics sampling på havoverflaten ved manta net er en mye brukt metode for prøvetaking av microplastics på havoverflaten, men hittil har det ikke vært noen enhetlig metodikk. Et stort volum av vann kan filtreres gjennom manta nettet, og dermed muligheten for å innestenge et relevant antall microplastics er høy, og resultatene er oppfattet å være pålitelig. Sammenlignbare resultater mellom ulike prøver er sikret av normalisering. I vårt tilfelle ble konsentrasjonene relatert til prøveområdet ved å multiplisere trål avstand av den horisontale bredde av nettet åpningen. Et annet alternativ er å benytte en strømningsmåler, settes til nettet åpningen. Anvendelsen av en strømningsmåler er mulig siden den manta net med sine sidevinger er meget stabil på havoverflaten, og dermed hopper på bølgene er minimal. En strømningsmåler registrerer volum av filtrert vann, og således gjør det mulig for normalisering av resultater per volum av samplet vann ^16.

<p class="jove_content"> De mest brukte djevel garn ha rundt 300 mikrometer maskevidde og er 3 til 4,5 m lang. Disse dimensjonene var optimalisert for å unngå tilstopping av nettet og å tillate sampling et volum vann så stor som mulig. Trålhastighet anbefales å være mellom 2-3 knop, men det er avhengig av bølgehøyde, vindstyrke og havstrømmer. Det er meget viktig at manta nettet er under tilsyn hele tiden under prøvetaking, og hvis det begynner å hoppe, må trålhastigheten bli redusert. Trål tid anbefales å være rundt 30 minutter, men er avhengig av seston konsentrasjoner. Det kan skje at seston noen ganger tresko manta nettet. I dette tilfellet trålingen må stanses umiddelbart, ellers mikroplastpartiklene kan gå tapt, og nettet kan bli skadet. Manta net er det som oftest fast fra siden av fartøyet. Dette er også den mest hensiktsmessige alternativet, mens manta nettet er sikkert ute av kjølvannet sonen. I noen undersøkelser manta netto ble løst fra akterenden av skipet^{17, 18,} men i så fall må du være sikker på at nettet er ute av kjølvannet sonen. Avstanden, på hvilken trålen er satt for prøvetaking, må bestemmes individuelt, ettersom sonen av turbulens forårsaket av fartøyet avviker fra størrelsen på fartøyet og fra hastigheten av båten ^{19, 20.}

Separering av mikropartikler fra havoverflaten prøvene gjøres oftest bare ved visuell identifikasjon ^21. Partikler større enn 1 mm kan lett identifiseres med det blotte øye, mens partikler mindre enn 1 mm krever bruk av et stereomikroskop. For å redusere muligheten for forvirrende de ikke-plast partikler med plast seg, ved hjelp av polarisering lys på stereomicroscopes anbefales. Muligheten for feilidentifisering av plast partikler blir høyere med mindre partikler. Således partikler> 0,5 mm bare kan identifiseres visuelt ^21, ved anvendelse av stereomikroskopet. For partikler som er mindre enn 0,5 mmen ekstra, mer nøyaktig metode er nødvendig for eksempel mikro ATR-FTIR spektroskopi ^21.

Under prosessen med microplastics atskillelse fra prøven muligheten for kontaminering av prøver med de luftbårne filamenter er meget høy. Av denne grunn, kontrollere petriskåler stående åpen på arbeidsbordet er sterkt anbefalt for identifisering av potensielle forurensnings luftbårne partikler. Nemlig, kvaliteten på dataene avhenger sterkt av: 1) presisjonen til personen som arbeider med prøven, 2) kvaliteten og forstørrelse av stereomikroskopet, og 3) mengden av organisk stoff i prøven ^16. Etter visuell identifisering er det sterkt anbefalt å analysere de sorterte partikler med en av de tilgjengelige teknikker for kjemisk identifikasjon av materialet ^8.

Det finnes flere metoder for identifikasjon polymer, hvorav de FTIR-spektroskopi og Raman-spektroskopi er de mest frekvently brukt ^22. FTIR og Raman-spektroskopi er komplementære teknikker og deres nøyaktighet er lik. I protokollen, FTIR og mikro FTIR-spektroskopi med "attenuated total reflektans" (ATR) presentert. De er enkle å bruke og de muliggjør raske og nøyaktige resultater. Plastpolymerer besitter meget spesifikt infrarødt (IR) spektra med forskjellige båndmønstre, og dermed gjør IR-spektroskopi en optimal teknikk for identifisering av microplastics ^21. Energien av IR-stråling eksiterer en spesifikk molekyl vibrasjon ved interaksjon med en prøve, som muliggjør måling av den karakteristiske IR-spektra ^22. FTIR spektroskopi kan også gi ytterligere informasjon om partikler som intensiteten av oksidasjon ²³ og nivå av nedbrytning ^24. Mens ATR-FTIR er egnet for kjemisk identifisering av større partikler (> 0,5 mm), kan mikro ATR-FTIR-spektroskopi gir informasjon om den kjemiske struktur av partikler & #60; 0,5 mm, fordi den kombinerer funksjonen av et mikroskop og et infrarødt spektrometer.

Før bruk av FTIR og mikro FTIR spektroskopi, mikropartiklene må på forhånd tørket, ettersom vann absorberer IR-stråling ^22, og renset, i tilfelle de er dekket med biofilm og / eller andre organiske og uorganiske tilhengere, som kan innvirke på IR-spektra. De fleste ikke-invasiv måte å rense prøver er ved omrøring og spyling med friskt vann ^25. Hvis dette ikke er tilstrekkelig, da bruk av 30% hydrogenperoksyd er anbefalt. Alle andre metoder kan ha negative effekter på mikropartikler (f.eks ultralyd kan videre bryte partikler, kan sterkt sure eller alkaliske løsninger skade flere plast polymerer, etc.), og derfor anbefales ikke bruk. Mer lovende er bruk av en sekvensiell enzymatisk fordøyelse som en plast vennlig rensetrinn. Rensing ved hjelp av ulike tekniske enzymer (f.eks lipase, etmylase, proteinase, kitinase, cellulase, proteinase-K) har blitt brukt til å redusere en biologisk matrise av plankton og dermed viste seg å være en verdifull teknikk for å minimere matrix gjenstander under FTIR spektroskopi målinger ^22.

Separasjon av microplastics av ​​visuell identifisering og kjemisk identifisering av utvalgte partikler er begge ekstremt tidkrevende prosesser. Dette arbeidet må gjøres med en nøyaktig og tålmodig person som har erfaring med stereomikroskoper, ikke bare i å gjenkjenne plast partikler, men også i å gjenkjenne biologisk materiale. Selv en erfaren person kan ikke diskriminere alle mulige mikropartikler utvetydig fra kitin eller diatomfragmentenes ^22. Derfor feilhyppigheten av visuell sortering i området fra 20% ²⁶ 70% ²¹ og øker med avtagende partikkelstørrelse.

Materials

In this protocol no specific equipment or reagents were used.