Summary

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Published: January 27, 2017
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Summary

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Abstract

Vertikale Schnittpräparate sind in der erwachsenen Säugetier-Netzhaut zu untersuchen Schaltung und Signalübertragung aufgebaut. Die Ebene der in diesen Zubereitungen sectioning senkrecht zu der Netzhautoberfläche, wodurch es ideal für die Untersuchung von radial ausgerichteten Neuronen wie Photorezeptoren und bipolaren Zellen machen. Jedoch sind die großen dendritischen Dorne von horizontalen Zellen, Weitfeld amacrine Zellen und Ganglionzellen meist abgestumpften, in diesen Zellen merklich verringert synaptische Aktivität zu verlassen. Während Ganglionzellen und Vertriebenen Amakrinzellen in einer ganzen montierten Vorbereitung der Netzhaut untersucht werden können, horizontalen Zellen und amacrine in der inneren Kernschicht befindlichen Zellen sind nur schwer zugänglich für Elektroden in ganzen Retinagewebe.

Um eine maximale Zugänglichkeit und synaptic Integrität zu erreichen, entwickelten wir eine horizontale Schnittpräparat der Maus Retina und untersucht die Signalübertragung an der Synapse zwischen den Photorezeptoren und horizontalenZellen. Horizontal Sektionieren erlaubt (1) eine einfache und eindeutige visuelle Identifizierung der horizontalen Zellkörper für eine Elektrode Targeting, und (2) Erhaltung der erweiterten horizontalen Zelle dendritischen Feldern, als Voraussetzung für eine intakte und funktionelle cone synaptischen Eingang horizontal Zelle Dendriten.

Horizontale Zellen aus horizontalen Schnitten Tonikum synaptische Aktivität im Dunkeln zeigte, und sie reagierten Lichtblitze mit einer Reduktion der nach innen gerichteten Strom und verminderte synaptische Aktivität zu informieren. Immunzytochemische deutet darauf hin, dass fast alle Kegel innerhalb der dendritischen Feld von einer horizontalen Zellsynapsen mit seiner peripheren Dendriten etablieren. Die horizontale Scheibe Zubereitung ist daher gut geeignet, um die physiologischen Eigenschaften von horizontal erweitert Netzhautneuronen sowie sensorischen Signalübertragung und Integration in ausgewählten Synapsen zu studieren.

Introduction

Visuelle Information wird codiert als dynamisches räumlich-zeitlichen Muster der Photorezeptoraktivierung und die Band Synapse zwischen Photorezeptoren und zweiter Ordnung Neuronen bestimmt die Downstream Übertragung von visuellen Informationen. Die vertikale slice Herstellung der Säugernetzhaut ist ein sehr wertvolles Werkzeug Signalverarbeitung in vertikalen Bahnen zu untersuchen, dh zwischen Photorezeptoren und bipolaren Zellen und zwischen den bipolaren Zellen und einige Arten von amacrine Zelle 1, 2, 3, 4.

Allerdings vertikale Schnitte verursacht immer schwerer Abschneiden der dendritischen Felder vieler retinalen Neuronen, zu erheblichen Verlust an synaptischen Kontakten führt. Vor allem in der äußeren Netzhaut werden horizontale Zellen betroffen aufgrund ihrer seitlich ausbreiten erweiterten dendritischen Felder und Axonterminal Systeme 5. In einer vertikalenScheibe Vorbereitung, die synaptischen Eingang von Hunderten von Kegel Photorezeptor-Terminals an den Dendriten einer horizontalen Zelle so zu vereinzelten Kontakten reduziert wird. Dies könnte ausreichen, um die Eigenschaften der einzelnen Synapsen zu studieren, aber es funktioniert bei weitem nicht die Signalverarbeitungsfähigkeiten zugrunde liegen die synchronisierte Aktivierung von Photorezeptor-Band Synapsen darstellen.

Wir entwickelten daher eine horizontale Schnittpräparat, die horizontal Zelle Dendriten intakt und funktionsfähig fast alle des Kegels Photorezeptor synaptischen Eingangs verlässt. Die Ebene der Unterteilung läuft an der Oberfläche der Netzhaut parallel, im Idealfall durch die innere Kernschicht zwischen den horizontalen Zellen und amakrinen Zellen zu schneiden. Somit sind horizontale Schnitte der äußeren Netzhaut enthält, erstellt auf der präsynaptischen Ort, Photorezeptoren mit inneren und äußeren Segmente sowie synaptischen Terminals und horizontalen Zellen und bipolare Zellen auf der postsynaptischen Ort. Die Zubereitung ist gut geeignet, to untersuchen koordinierte synaptischen Eingänge in horizontale Zelle Dendriten von allen Zapfen-Photorezeptoren in seinem dendritischen Feld. Es könnte daher als nützlich erweisen, um besser auf die Funktionsweise des Photorezeptors ribbon Synapse verstehen, die für die Übertragung von visuellen Informationen von der Matrix der Fotorezeptoraktivierung in eine postsynaptische Reaktion entscheidend ist.

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche, herausgegeben von der Bundesrepublik Deutschland durchgeführt. Hinweis: Da das Netzhautgewebe während längerer Teile dieses Verfahren frei von Sauerstoff sein, alle Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden soll. Mäuse sollte mindestens 3 Stunden vor der Dissektion dunkel angepasst werden. Um Licht Anpassung der Netzhaut, die Vorbereitung zu vermeiden und Schneiden sollte unter dim rotes Licht du…

Representative Results

In horizontalen Schichten der Netzhaut der Maus konnte horizontal Zellkörper leicht nach ihrer einzigartigen Morphologie mit mehreren primären Dendriten von einer polygonal Zellenkörper (1A) austretende identifiziert werden. Horizontal Zellkörper in der Nähe der Oberfläche der Scheibe angeordnet wurden routinemäßig zugänglich für Patch-Clamp-Elektroden. Während der Aufnahmen wurden die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefüllt, ihre komplizier…

Discussion

Im Gegensatz zu den vertikalen Scheiben wird die dendritische Morphologie von radial ausgerichteten Neuronen wie horizontale Zellen und Amakrinzellen gut erhalten. Im Vergleich zum gesamten Netzhaut Präparate sind diese Zelltypen leicht zugänglich für Mikroelektroden und kann sowohl von elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren untersucht werden. Hier konzentrieren wir uns auf der äußeren Netzhaut; jedoch ein ähnlicher Ansatz wurde insbesondere berichtet für amakrinen Zellen der inneren Retina <sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

Materials

Ames' Medium Sigma A1420
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Hepes Sigma H3375
Carbogen Air Liquide
Agarose Sigma A9045
35-mm petri dish (plastic) Nunc Thermofisher 150318
Glass petri dish Chemoline 50-1470-40
Isoflurane Dispensary university hospital
Vibratome injector blade Biosystems 39053250
Vibratome Leica Microsystems VT1200
Vibrocheck Leica Microsystems
Microwave
Water bath
Forceps
20-gauge needles
Spring scissors
Curved scalpel blades
Stereo microscope
Plastic Pasteur pipette
Glass Pasteur pipette

References

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Cite This Article
Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies. J. Vis. Exp. (119), e55173, doi:10.3791/55173 (2017).

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