लाइव सेल इमेजिंग और ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में Angiotensin के 3 डी विश्लेषण रिसेप्टर टाइप 1 ए तस्करी confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग
Summary
यहाँ हम छवि कोशिकाओं endocytosis के दौरान हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग एंजियोटेनसिन प्रकार 1 ए रिसेप्टर्स एंजियोटेनसिन द्वितीय उपचार द्वारा शुरू व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस तकनीक में एक दूसरे फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबलिंग लाइसोसोम, और फिर सॉफ्टवेयर का उपयोग समय के साथ तीन आयामों में रिसेप्टर और लाइसोसोम के सह स्थानीयकरण विश्लेषण करने के लिए भी शामिल है।
Abstract
लाइव सेल इमेजिंग एक साथ एंजियोटेनसिन द्वितीय (आंग द्वितीय) के साथ उत्तेजना के बाद ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK) कोशिकाओं में एंजियोटेनसिन प्रकार 1 ए रिसेप्टर्स (एटी 1 ए आर) और intracellular डिब्बों के समय चूक छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। HEK कोशिकाओं क्षणिक प्लास्मिड डीएनए एटी 1 ए बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ टैग आर युक्त के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। लाइसोसोम एक लाल फ्लोरोसेंट रंजक के साथ की पहचान कर रहे हैं। लाइव सेल छवियों आंग द्वितीय उत्तेजना के बाद एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन पर कब्जा कर लिया है और समय के साथ तीन आयामों (3 डी, voxels) में सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। लाइव सेल इमेजिंग रिसेप्टर की तस्करी की जांच के लिए सक्षम बनाता है और निर्धारण के साथ जुड़े घालमेल से बचा जाता है, और विशेष रूप से, हानि या EGFP टैग झिल्ली रिसेप्टर्स की artefactual विस्थापन। इस प्रकार, के रूप में व्यक्तिगत कोशिकाओं समय के माध्यम से ट्रैक कर रहे हैं, रिसेप्टर्स की subcellular स्थानीयकरण imaged और मापा जा सकता है। छवियाँ sufficientl का अधिग्रहण किया जाना चाहिएY तेजी से तेजी से पुटिका आंदोलन पर कब्जा करने के लिए। फिर भी, तेज इमेजिंग गति पर, एकत्र फोटॉनों की संख्या कम है। समझौते भी आदेश इमेजिंग गति हासिल करने में voxel आकार की तरह इमेजिंग मापदंडों के चयन में किया जाना चाहिए। लाइव सेल इमेजिंग के महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों के नाम पर कुछ करने के लिए प्रोटीन की तस्करी, प्रवास, प्रसार, सेल चक्र, apoptosis, भोजी और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और गतिशीलता, अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं।
Introduction
समग्र लक्ष्य के लिए एक रिसेप्टर agonist के साथ उपचार के बाद समय और विशिष्ट subcellular अंगों के साथ रिसेप्टर colocalization के अंतरिक्ष में मात्रात्मक सबूत प्राप्त करने के लिए है। इस प्रकार, तत्काल लक्ष्य यहाँ लाइसोसोम के समय चूक confocal छवियों और एक transmembrane मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में रिसेप्टर (HEK) अभिकर्मक के बाद और 3 डी में इमेजिंग डेटा बाद में इकट्ठा और विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक को रिसेप्टर के वितरण को मापने के लिए फैले कब्जा करने के लिए है लाइसोसोम। endocytosis दौरान लाइसोसोम या अन्य अंगों के साथ एक transmembrane रिसेप्टर के एक साथ की तस्करी की जांच जब रिसेप्टर ligand से सक्रिय मदद कर सकते हैं कि कैसे निर्धारित transmembrane रिसेप्टर शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत नियंत्रित किया जाता है।
1 ए पर आर, मॉडल कोशिकाओं प्रणालियों में आंग द्वितीय के साथ इलाज के बाद लाइसोसोम में अपमानित होना माना जाता है, मुख्य रूप से HEK293 1 आरईसी के बहुमत हालांकिeptors मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली को बाद में रीसाइक्लिंग के लिए Multivesicular रीसाइक्लिंग endosomes में स्थानीय कर रहे हैं, जबकि ligand, आंग द्वितीय, के थोक lysosome 2, 3, 4, 5 में अपमानित है। हाल ही में, ली एट अल। Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) और प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (flim) तकनीक का उपयोग कर प्रदर्शन किया है कि एटी 1 ए आर colocalizes (पर ~ 10 एनएम पैमाने) LAMP1 के साथ, एक लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन सुझाव है कि रिसेप्टर के कम से कम कुछ करने के लिए लक्षित और अपमानित किया जाता है लाइसोसोम 6 से। इन लेखकों ने उल्लेख किया कि लाइसोसोमल अवरोध क्लोरोक्वीन एटी 1 ए आर-LAMP1 संघ है जो पिछली रिपोर्टों का सुझाव क्लोरोक्वीन का एक प्रभाव देर endosomes या लाइसोसोम के साथ autophagosomes के विलय को ब्लॉक करने के लिए है कि के साथ संगत है अवरुद्ध। अन्य अप्रत्यक्ष तरीकों पर 1 ए आर एल निर्धारित करने के लिएलाइसोसोम में ocalization bafilomycin का उपयोग किया है, एटी लाइसोसोम 3, 4, 5, 6, 7, 8 में 1 ए आर उपस्थिति अनुमान करने के लिए एक लाइसोसोमल अवरोध करनेवाला।
लाइव सेल इमेजिंग सेल की मात्रा, और नुकसान / मद्धिम / GFP-कैमेरिक रिसेप्टर के पुनर्वितरण पर नियतन के संभावित प्रभावों से बचा जाता है। पिछले अध्ययनों से तय कोशिकाओं पर भरोसा किया है colocalization या लाइसोसोम या जैसे रिसेप्टर बाध्यकारी surrogates के साथ लेबल जीवित कोशिकाओं का उपयोग कर के साथ रिसेप्टर के सह घटना निर्धारित करने के लिए β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6। कताई डिस्क confocal या लेजर स्कैनिंग बिंदु conf का उपयोग अन्य GPCRs का लाइव सेल इमेजिंगOcal GaAsP या HYD डिटेक्टरों से लैस सूक्ष्मदर्शी जांचकर्ताओं सक्षम internalization और व्यक्तिगत 30 एस अंतराल 9, 10 में जेड के ढेर में imaged कोशिकाओं में रिसेप्टर्स की तस्करी के निरीक्षण करने के लिए। हालांकि तब भी जब जीवित कोशिका Z ढेर तेजी से एकत्र कर रहे हैं, विश्लेषण केवल प्रत्येक ढेर, 2 डी 10 में IE के भीतर एक ही विमान के चयन के बाद हो सकता है। इस सवाल में भली भाँति GPCR या tyrosine kinase रिसेप्टर के अध्ययन के लिए पर्याप्त हो सकता है, पर 1 ए रुपये पुटिकाओं कि समय के साथ आकार और स्थिति को बदलने और इस तरह स्वाभाविक रूप से अधिक पर्याप्त रूप से हर समय बिंदु पर एक प्रतिनिधि एकल टुकड़ा का उपयोग नमूना करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं में जम जाता है। अच्छी तरह से सेल के माध्यम से और आकार और स्थिति में भिन्न पुटिकाओं के प्रत्येक उप-जनसंख्या पता लगाने के लिए एटी 1 ए आर लेबल के मार्ग का निर्धारण करने के लिए, हम इन परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए और होना करने के लिए 3 डी इमेजिंग और 3 डी विश्लेषण के लिए एक विधि तैयार कर लिया है ऐसे लाइसोसोम के रूप में विभिन्न intracellular डिब्बों की लेबलिंग के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया।
जांचकर्ताओं को लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे सेल और आंग द्वितीय उत्तेजना के बाद subcellular डिब्बों को अपने स्थानांतरण में कम से 1 ए आर के आंदोलन की कल्पना कर सकते हैं। Subcellular डिब्बों फ्लोरोसेंट प्रोटीन काइमेरा या अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल भी क्रम में 200 एनएम की एक न्यूनतम संकल्प के साथ subcellular अंगों में रिसेप्टर्स स्थानीय बनाना बनाम जंगली प्रकार रिसेप्टर्स उत्परिवर्तित तुलना करने के लिए या औषधीय उपचार के बाद परिवर्तन का पता लगाने के लिए पहली बार एक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तकनीक सुलभ है, क्योंकि यह किसी भी confocal रहते सेल इमेजिंग के लिए सुसज्जित खुर्दबीन पर बाहर किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के सापेक्ष कम वृद्धि की विशेषज्ञता और उपकरण झल्लाहट / लिए flim / BRET तकनीक है जो आणविक बातचीत 6 का पता लगाने के लिए बाहर ले जाने की जरूरत के साथ विरोधाभासों,"xref"> 11। इन मापों उच्च संकल्प (~ 10 एनएम) और subcellular अंगों के भीतर स्थानीयकरण अनुमान लगाया जाता है पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को परिभाषित। ये अधिक उन्नत तकनीकों का पालन करें और आगे के बजाय subcellular डिब्बों के माध्यम से रिसेप्टर्स के पारित होने के लिए ब्याज की आणविक बातचीत, परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, और वे सीधे सेल 11 के भीतर विशिष्ट समय और स्थानों पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रदर्शित करता है। लिए flim, एक झल्लाहट तकनीक स्वीकर्ता एकाग्रता की स्वतंत्र, सबसे अधिक बार तय नमूने पर प्रदर्शन के बाद से छवि अधिग्रहण धीमी है। इसके विपरीत, अनुपात झल्लाहट तेजी इमेजिंग और बातचीत प्रोटीन की उच्च संकल्प colocalization प्रदान करता है। अनुपात झल्लाहट का नुकसान यह है कि इमेजिंग widefield महामारी प्रतिदीप्ति इमेजिंग गति हासिल करने के लिए और पूरे सेल, कम संकल्प और अंगों 12 के विपरीत है, जिसके परिणामस्वरूप शामिल करने के लिए इस्तेमाल करता है। Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) एक और हैउन्नत तकनीक है कि GPCRs करने के लिए लागू किया गया है समय 11 से अधिक आणविक निकटता के अधिग्रहण को मापने के लिए। इस तकनीक में एक प्रोटीन fluorophore molecularly बांटा गया है और प्रत्येक आधा प्रश्न में दो प्रोटीन से एक के लिए जुड़ा हुआ है। जब ब्याज बाँध के दो प्रोटीन एक दूसरे को, chimeric टैग के कुछ हिस्सों प्रतिदीप्ति और बढ़ प्रतिदीप्ति समय के साथ मात्रा निर्धारित प्राप्त करने के लिए फिर से इकट्ठा।
यहाँ, हम आंग द्वितीय उत्तेजना और निम्न आंग द्वितीय उत्तेजना लाइसोसोम करने के लिए एटी 1 ए आर भाँति के वितरण में संभावित परिवर्तन पर सेल में एटी 1 ए आर के अवैध व्यापार का अध्ययन करने के लिए छवि मात्रा का ठहराव के साथ मिलकर रहते सेल इमेजिंग के लिए एक सरल तकनीक मौजूद है। इस तकनीक के लिए अंतिम उपयोग जंगली प्रकार और उत्परिवर्तित रिसेप्टर्स की तुलना झिल्ली की तस्करी में मतभेदों को चिह्नित करने के लिए है। इन मतभेदों तंत्र (s) है कि प्रभाव में 1 ए आर अग्रणी कंपनियों के शारीरिक गतिविधियों की पहचान करने में मदद मिलेगीरक्तचाप के विनियमन के लिए एनजी।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रारंभिक यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों का वर्णन है कि 24 मिनट के बजाय एक छोटे से समय के पाठ्यक्रम पर, लाइसोसोम करने के लिए एटी 1 ए आर-GFP के वितरण में कोई सराहनीय परिवर्तन हुआ। सामान्य तौर पर, लाइसोसोम को भली भ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत शोध कार्य कॅथ्रीन सैंडबर्ग को अनुदान R01 HL121456-01A1 द्वारा समर्थित किया गया। इस काम माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग साझा संसाधन (MISR) जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर में जो आंशिक रूप से संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से P30-CA051008 द्वारा वित्त पोषित है में एक Leica SP8 AOBS की उपलब्धता द्वारा अलावा समर्थित किया गया। हम कृतज्ञता पीटर जॉनसन द्वारा लीका SP8 इमेजिंग सहायता, और कार्ल जीस माइक्रोस्कोपी LLC के अल्मा अर्नोल्ड द्वारा प्रदान की इमेजिंग की सहायता से जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय में थॉमस COATE, जीव विज्ञान विभाग की प्रयोगशाला में जीस LSM880 के उपयोग को स्वीकार करते हैं। इस पांडुलिपि में सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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