Live-Cell Imaging og 3D Analyse av angiotensin reseptor type 1a Trafficking i transfekterte humane embryonale nyreceller ved hjelp konfokalmikroskopi
Summary
Her presenterer vi en protokoll til bildet celler uttrykker grønt fluorescerende protein-merket angiotensin type 1A reseptorer under endocytose initiert av angiotensin II-behandling. Denne teknikken innbefatter merking lysosomer med et andre fluorescerende markør, og deretter anvendelse av programvare for å analysere de ko-lokalisering av reseptor og lysosomet i tre dimensjoner over tid.
Abstract
Levende celle avbildning blir brukt til å samtidig fange time-lapse bilder av angiotensin type 1A-reseptorer (AT 1a R) og intracellulære i transfekterte humane embryonale nyre-293 (HEK) celler etter stimulering med angiotensin II (Ang II). HEK celler er transient transfektert med plasmid DNA inneholder AT 1a R tagget med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). Lysosomer er identifisert med en rød fluorescerende fargestoff. Levende-celle bildene er tatt på en laser scanning confocal mikroskop etter Ang II stimulering og analysert av programvare tredimensjonalt (3D, voxel) over tid. Levende-cell imaging gjør undersøkelser i reseptoren menneskehandel og unngår forundrer forbundet med fiksering, og i særdeleshet, tap eller gjenstands forskyvning av EGFP-merkede membranreseptorer. Således, som de enkelte celler blir sporet gjennom tid, den subcellulære lokalisering av reseptorene kan avbildes og måles. Bildene må være kjøpt sufficiently raskt å fange raske vesikkel bevegelse. Likevel, med høyere bildehastighet, er antall fotoner innsamlede redusert. Kompromisser må også gjøres ved valg av avbildningsparametre som voxel størrelse for å oppnå avbildning hastighet. Betydelige anvendelser av levende celle bildebehandling er å studere protein trafficking, migrasjon, spredning, cellesyklus, apoptose, autofagi og protein-protein interaksjon og dynamikk, for å nevne noen.
Introduction
Det overordnede målet er å få kvantitative bevis i tid og rom av reseptor colocalization med spesifikke subcellulære organeller etter behandling med en reseptor agonist. Dermed umiddelbare mål her er å fange opp time-lapse confocal bilder av lysosomer og et trans spenner reseptor i humane embryonale nyreceller (HEK) etter transfeksjon og deretter å montere og analysere bildedata i 3D for å kvantitativt måle levering av reseptoren til lysosomer. Gransker samtidig smugling av et trans reseptoren med lysosomer eller andre organeller under endocytose når den aktiveres av ligand kan bidra til å bestemme hvordan den transmembrane reseptor er regulert under fysiologiske og patofysiologiske forhold.
AT 1a R antas å bli degradert i lysosomer etter behandling med Ang II i modell celler systemer, primært HEK293 en selv om de fleste av receptors er primært lokalisert i multivesikulære gjenvinnings endosomer for senere gjenvinning for å plasmamembranen mens mesteparten av liganden, Ang II, er degradert i lysosomet 2, 3, 4, 5. Mer nylig, Li et al. demonstreres ved anvendelse Förster resonans energioverføring (FRET) og fluorescens levetid avbildningsmikroskopi (FLIM) teknikker som AT 1a R colocalizes (på ~ 10 nm skala) med LAMP1, en lysosomal membranprotein som tyder på at i det minste noen av reseptoren er rettet mot og degradert av lysosomer 6. Disse forfatterne bemerkes at det lysosomale inhibitoren klorokin blokkert AT 1a R-LAMP1 krets som er i overensstemmelse med tidligere rapporter som tyder på at en effekt av klorokin er å hindre sammensmelting av sene endosomer eller autophagosomes med lysosomer. Andre indirekte metoder for å bestemme AT 1a R localization i lysosomer har utnyttet bafilomycin, en lysosomal inhibitor å antyde AT 1a R tilstedeværelse i lysosomer 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Levende-cell imaging unngår potensielle effektene av fiksering på cellevolumet, og tap / dimming / omfordeling av GFP-kimære reseptor. Tidligere studier har stolt på fikserte celler for å bestemme colocalization eller samtidig forekomst av reseptoren med lysosomer eller ved hjelp av levende celler merket med reseptorbindende surrogater slik som β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Levende-cell imaging av andre GPCR ved hjelp av roterende disk confocal eller laserpunkt scanning confocal mikroskoper utstyrt med Gaasp eller hyd detektorer aktivert etterforskere å observere intern og smugling av reseptorer i enkeltceller fotografert i z-stabler på 30 s intervaller 9, 10. Men selv når levende celle z-stabler er raskt samlet inn, kan analysen kun skje etter valget av en enkelt plan i hver stabel, dvs. i 2D 10. Selv om dette kan være tilstrekkelig for å studere internalisert GPCR eller tyrosinkinase-reseptoren i spørsmålet, AT 1a Rs akkumuleres i vesikler som endrer størrelse og posisjon over tid, og dermed er iboende vanskeligere å tilstrekkelig prøve ved bruk av en representativ enkelt stykke ved hvert tidspunkt. Å grundig bestemme ruten for den merkede AT 1a R gjennom cellen og for å detektere hver undergruppe vesikler forskjellige i størrelse og posisjon, har vi utviklet en metode for 3D-avbilding og 3D-analyse for å spore disse endringene og å være brukes i forbindelse med merking av forskjellige intracellulære såsom lysosomer.
Etterforskerne kan bruke denne protokollen for live-cell imaging å direkte visualisere bevegelsen av AT 1a R inn i cellen og dens overføring til subcellulære avdelinger følgende Ang II stimulering. Subcellulære avdelinger er merket med fluorescerende proteinkimærer eller andre fluorescerende markører. Denne protokollen kan også brukes som en første tilnærming for å lokalisere reseptorer i subcellulære organeller med en oppløsning på minst 200 nm for å sammenligne muterte versus villtype-reseptorer eller for å oppdage endringer etterfølgende farmakologiske behandlinger. Teknikken er tilgjengelig, siden det kan utføres på hvilken som helst konfokalt mikroskop utstyrt for levende celle avbildning. Det er relativt enkelt med denne tilnærmingen står i kontrast til økt kompetanse og utstyr som trengs for å utføre FRET / FLIM / BRET teknikker som oppdager molekylære interaksjoner 6,"xref"> 11. Disse målingene definere protein-protein interaksjoner med høy oppløsning (~ 10 nm) og lokalisering innen subcellulære organeller er utledes. Disse mer avanserte teknikker brukes til å følge opp og videre definere molekylære interaksjoner av interesse, snarere enn passering av reseptorer gjennom subcellulære avdelinger, og de direkte viser protein-protein interaksjoner til bestemte tider og steder i cellen 11. FLIM, en FRET teknikk uavhengig av akseptor konsentrasjon, er oftest utført på faste prøver siden bildet oppkjøpet er tregere. I kontrast, gir forholdet FRET rask bildebehandling og høy oppløsning colocalization av samspill proteiner. Ulempen med forholdet FRET er at bilde benytter vidfelt epi-fluorescens å få bildebehandling fart og til å omfatte hele cellen, noe som resulterer i redusert oppløsning og kontrast for organ 12. Bioluminesens resonans energi overføring (BRET) er en annenavansert teknikk som har vært brukt til GPCR å måle oppkjøpet av molekylære nærhet over tid 11. I denne teknikken et protein fluoroforen er molekylært delt, og hver halvdel er knyttet til en av to proteiner i spørsmålet. Når de to proteiner av interesse bindes hverandre, de delene av det kimære tag re-montere for å erverve fluorescens og den økede fluorescens kvantifisert over tid.
Her presenterer vi en enkel teknikk for live-cell imaging kombinert med bilde kvantifisering å studere smugling av AT 1a R i cellen ved Ang II stimulering og potensiell endring i levering av internalisert AT 1a R til lysosomer følgende Ang II stimulering. Den endelige bruk av denne teknikken er å karakterisere forskjeller i membran handelen som sammenlignet villtype og muterte reseptorer. Disse forskjellene vil bidra til å identifisere mekanismen (e) som påvirker fysiologiske aktiviteter AT 1a R leading til regulering av blodtrykk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Foreløpige eksperimenter er presentert her viser at i løpet av en ganske kort tid løpet av 24 min, ingen vesentlig endring i levering av AT 1a R-GFP til lysosomene inntraff. Generelt, kan levering av internalisert reseptorer til lysosomer forekomme allerede i 15-20 min. Dette eksperimentet er konsistent med hypotesen om at mesteparten av internalisert AT 1a R er rettet mot store, perinukleære endosomer. Bevis for at i det minste noen AT 1a R kommer i lysosomer ble demonstrert av Li <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsarbeidet presenteres i dette manuskriptet ble støttet av tilskuddet R01 HL121456-01A1 til Kathryn Sandberg. Dette arbeidet ble støttet i tillegg av tilgjengeligheten av en Leica SP8 AOBS i Mikroskopi og Imaging delt ressurs (MISR) ved Georgetown University Medical Center som er delvis finansiert av P30-CA051008 fra National Institutes of Health i USA. Vi erkjenner takknemlig Leica SP8 bildebehandling hjelp av Peter Johnson, og bruk av Zeiss LSM880 i laboratoriet av Thomas Coate, Institutt for biologi ved Georgetown University med bildebehandling bistand fra Alma Arnold fra Carl Zeiss Mikros LLC. Innholdet i dette manuskriptet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
