Levande cell imaging och 3D analys av angiotensinreceptor typ 1a handel i transfekterade humana embryonala njurceller med hjälp av konfokalmikroskopi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll till bild celler som uttrycker grönt fluorescerande protein-märkt angiotensin typ 1A receptorer under endocytos initieras av angiotensin II behandling. Denna teknik omfattar märknings lysosomer med en andra fluorescerande markör, och sedan använder programvara för att analysera samlokalisering av receptor och lysosom i tre dimensioner över tiden.
Abstract
Live-cell imaging används för att samtidigt fånga tidsförlopp bilder av angiotensin typ 1A receptorer (AT 1a R) och intracellulära fack i transfekterade humana embryonala njur-293 (HEK) celler efter stimulering med angiotensin II (Ang II). HEK-celler är övergående transfekterade med plasmid-DNA innehållande AT 1a R taggade med förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP). Lysosomer identifieras med en röd fluorescerande färgämne. Live-cellbilder fångas på en laserskanning konfokalmikroskop efter Ang II stimulering och analyserades med programvara i tre dimensioner (3D, voxlar) över tiden. Live-cell imaging gör utredningar receptorhandel och undviker blandar ihop i samband med fixering, och i synnerhet förlust eller artefactual förskjutning av EGFP-märkta membranreceptorer. Således, såsom enskilda celler spåras genom tiden, subcellulära lokalisering av receptorer kan avbildas och mätas. Bilder måste förvärvas sufficiently snabbt för att fånga snabba vesikel rörelse. Men vid högre avbildningshastigheter, är antalet fotoner samlats minskas. Kompromisser måste också göras i valet av imaging parametrar som voxel storlek för att få utskriftshastighet. Betydande applikationer i levande cell imaging är att studera protein trafficking, migration, proliferation, cellcykeln, apoptos, autophagy och protein-proteininteraktioner och dynamik, för att bara nämna några.
Introduction
Det övergripande målet är att få kvantitativa belägg i tid och rum av receptor colocalization med specifika subcellulära organeller efter behandling med en receptoragonist. Således är det omedelbara målet för att fånga tidsförlopp konfokala bilder av lysosomer och en transmembranomspännande receptor i humana embryonala njurceller (HEK) efter transfektion och att därefter montera och analysera bilddata i 3D för att kvantitativt mäta leveransen av receptorn till lysosomer. Undersöker samtidig handel med en transmembranreceptor med lysosomer eller andra organ under endocytos när den aktiveras av receptorligand kan bidra till att avgöra hur transmembranreceptor regleras under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden.
AT 1a R antas brytas ned i lysosomer efter behandling med Ang II i modellceller system, främst HEK293 en även om majoriteten av receptors är primärt lokaliserade i multivesikulära återvinnings endosomer för senare återvinning till plasmamembranet medan huvuddelen av liganden, Ang II, degraderas i lysosomen 2, 3, 4, 5. Mer nyligen, Li et al. demonstreras med användning av Förster resonansenergiöverföring (FRET) och fluorescenslivstid avbildning mikroskopi (FLIM) tekniker som AT 1a R colocalizes (på ~ 10 nm-skala) med LAMP1, ett lysosomalt membranprotein vilket tyder på att åtminstone en del av receptorn är riktad till och bryts ned genom lysosomer 6. Dessa författare noterade att lysosomala inhibitor klorokin den blockerade AT 1a R-LAMP1 förening som är i linje med tidigare rapporter som tyder på att en effekt av klorokin är att blockera fusion av sena endosomer eller autophagosomes med lysosomer. Andra indirekta metoder för att avgöra 1a R localization i lysosomer har utnyttjat bafilomycin, ett lysosomalt hämmare att sluta AT 1a R närvaro i lysosomer 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Live-cell imaging undviker potentiella effekterna av fixering på cellvolymen, och förlust / mörkläggning / omfördelning av GFP-chimär receptor. Tidigare studier har förlitat sig på fixerade celler för att bestämma colocalization eller samtidig förekomst av receptorn med lysosomer eller med hjälp av levande celler märkta med receptorbindande surrogat såsom β-arrestin en, två, tre, fyra, fem, sex. Live-cell imaging andra GPCR med hjälp av snurrande skiva konfokala eller laserpunkt skanning confocal mikroskop utrustade med Gaasp eller hyd detektorer aktiverade utredare att observera internalisering och handel med receptorer i enskilda celler avbildas i z-stackar på 30 s intervall 9, 10. Men även då levande cell z-stackar snabbt samlas, kan analys endast ske efter urval av ett enda plan i varje stapel, dvs i 2D 10. Även om detta kan vara tillräckligt för att studera intern GPCR eller tyrosinkinasreceptor i fråga, AT 1a Rs ackumuleras i vesiklar som ändrar storlek och position över tid och därmed är till sin natur svårare att på ett adekvat prov med hjälp av en representativ enda skiva vid varje tidpunkt. Att grundligt fastställa vilken rutt märkt AT 1a R genom cellen och för att upptäcka varje subpopulation av vesiklar som skiljer sig i storlek och position, har vi utvecklat en metod för 3D-avbildning och 3D-analys för att spåra dessa förändringar och att vara används i samband med märkning av olika intracellulära avdelningar såsom lysosomer.
Utredarna kan använda detta protokoll för levande cell imaging att direkt visualisera rörelse AT 1a R in i cellen och dess överföring till subcellulära fack efter Ang II stimulering. Subcellulära fack är märkta med fluorescerande protein chimärer eller andra fluorescerande markörer. Detta protokoll kan också användas som ett första försök att lokalisera receptorer i subcellulära organeller med en upplösning på minst 200 nm för att jämföra muterat jämfört med vild-typ-receptorer eller för att upptäcka förändringar följande farmakologiska behandlingar. Tekniken är tillgänglig, eftersom den kan utföras på någon konfokal mikroskop utrustat för live-cell imaging. Den relativa lätthet med detta tillvägagångssätt kontrasterar med ökad kompetens och utrustning som behövs för att utföra FRET / FLIM / Bret tekniker som upptäcker molekylära interaktioner 6,"xref"> 11. Dessa mätningar definierar protein-proteininteraktioner med hög upplösning (~ 10 nm) och lokalisering inom subcellulära organeller är oavsiktliga. Dessa mer avancerade tekniker används för att följa upp och ytterligare definiera molekylära interaktioner av intresse, snarare än passagen av receptorer genom subcellulära fack och de direkt visar protein-proteininteraktioner på bestämda tider och platser i cellen 11. FLIM, en FRET teknik oberoende av acceptor koncentration, oftast utförs på fasta prover eftersom bilden förvärvet är långsammare. Däremot ger förhållandet FRET snabb avbildning och hög upplösning colocalization av interagerande proteiner. Nackdelen med förhållandet FRET är att avbildning använder Vidvinkel epi-fluorescens för att få utskriftshastighet och att inkludera hela cellen, vilket resulterar i lägre upplösning och kontrast organ 12. Bioluminescence resonansenergiöverföring (BRET) är en annanavancerad teknik som har använts för GPCR att mäta förvärv av molekylära närhet över tiden 11. I denna teknik ett protein fluorofor är molekylärt uppdelas och varje halva kopplade till en av två proteiner i fråga. När de två proteiner av intresse binder varandra, de delar av det chimära taggen återmontera att förvärva fluorescens och den ökade fluorescensen kvantifierades över tiden.
Här presenterar vi en enkel teknik för levande cell imaging tillsammans med bild kvantifiering för att studera handel med AT 1a R i cellen på Ang II stimulering och potentiella förändringar i leverans av intern AT 1a R lysosomer efter Ang II stimulering. Den slutliga användningen för denna teknik är att karakterisera skillnader i membran trafficking som jämför vildtyp och muterade receptorer. Dessa skillnader kommer att bidra till att identifiera mekanismen (s) som påverkar fysiologiska aktiviteter AT 1a R leading till regleringen av blodtrycket.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preliminära experiment som presenteras här visar att över en ganska kort tid under 24 minuter, ingen märkbar förändring i leveransen av AT 1a R-GFP till lysosomer inträffade. I allmänhet kan leverans av internaliserade receptorer lysosomer ske så tidigt som 15-20 minuter. Detta experiment är i överensstämmelse med hypotesen att den största delen av internaliserade AT 1a R är riktad till stora, perinukleära endosomer. Bevis för att åtminstone en del AT 1a R anländer i ly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet forskning som presenteras i detta manuskript stöddes av bidrag R01 HL121456-01A1 till Kathryn Sandberg. Detta arbete stöddes dessutom av tillgången på en Leica SP8 AOB-bakterier i Mikroskopi och Imaging delad resurs (MISR) vid Georgetown University Medical Center som delvis finansieras av P30-CA051008 från National Institutes of Health i USA. Vi tackar Leica SP8 avbildning hjälp av Peter Johnson, och användningen av Zeiss LSM880 i laboratorium Thomas Coate, Biologiska institutionen vid Georgetown University med avbildning bistånd från Alma Arnold Carl Zeiss Microscopy LLC. Innehållet i detta manuskript är enbart ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
