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Biology

स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: बरकरार दिल में सेलुलर संकेतों इमेजिंग

Published: March 8, 2017 doi: 10.3791/55202
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced
* These authors contributed equally

Summary

दिल में, आणविक घटनाओं अंग की बिजली और सिकुड़ा समारोह समन्वय। स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी यहाँ प्रस्तुत तकनीकों का एक सेट बरकरार दिलों में सेलुलर चर की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है। हृदय समारोह को परिभाषित करने के लिए तंत्र की पहचान करना समझ में महत्वपूर्ण कैसे दिल रोग स्थितियों के तहत काम करता है।

Abstract

दिल में, आणविक संकेत दे अध्ययन आमतौर पर पृथक myocytes में प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इस तरह ischemia और arrhythmias के रूप में कई रोग स्थितियों केवल पूरी तरह से पूरे अंग स्तर पर समझा जा सकता है। यहाँ, हम स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LFFM) के स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि अक्षुण्ण दिल में सेलुलर संकेतों के माप की अनुमति देता प्रस्तुत करते हैं। तकनीक एक Langendorff perfused दिल और ऑप्टिकल फाइबर फ्लोरोसेंट संकेतों को रिकॉर्ड करने का एक संयोजन पर आधारित है। LFFM हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के क्षेत्र में विभिन्न अनुप्रयोगों के सामान्य और रोग की शर्तों के तहत दिल का अध्ययन करने के लिए है। एकाधिक हृदय चर अलग फ्लोरोसेंट संकेतक उपयोग पर नजर रखी जा सकती है। ये साइटोसोलिक [सीए 2 +], इंट्रा-sarcoplasmic जालिका [सीए 2 +] और झिल्ली क्षमता शामिल हैं। बहिर्जात फ्लोरोसेंट जांच उत्साहित हैं और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति LFFM epifluorescence तकनीक के तीन अलग-अलग व्यवस्थाओं के साथ पायाइस अखबार में प्रस्तुत कर रहा है। इन तकनीकों के बीच केंद्रीय मतभेद उत्तेजना के लिए और जिस तरह से उत्तेजना प्रकाश संग्राहक है पर इस्तेमाल किया प्रकाश स्रोत के प्रकार हैं। स्पंदित LFFM (PLFFM) लेजर प्रकाश दालों का उपयोग करता है, जबकि निरंतर तरंग LFFM (CLFFM) उत्तेजना के लिए निरंतर लेजर प्रकाश का उपयोग करता है। अंत में, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) एक तिहाई प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया। इस गैर सुसंगत व्यवस्था स्पंदित एलईडी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (PLEDFM) कहा जाता है।

Introduction

दिल हृदय प्रणाली के केंद्रीय अंग है। दिल की संकुचन intracellular में वृद्धि [सीए 2 +] द्वारा शुरू की है। Intracellular सीए 2 रिलीज में बिजली के excitability और परिवर्तन के बीच संबंध ऐतिहासिक रूप enzymatically अलग कोशिकाओं 1, 2 में अध्ययन किया गया है। हालांकि, हृदय कोशिकाओं, विद्युत हैं पाचन और यंत्रवत्, 4 3 युग्मित। जब अलग-थलग, myocytes केवल शारीरिक रूप से uncoupled नहीं हैं, लेकिन विभिन्न परतों से myocytes हदबंदी 5 दौरान मिलाया जाता है। इसके अलावा, भारी लाभ है कि वोल्टेज क्लैंप की शर्तों के तहत अलग कक्षों के अध्ययन से उभरा है, 6, 7, 8 एक बिजली के संकोश alwa के रूप में दिल के स्वभाव के बावजूदवाईएस कैसे कार्यात्मक अलग ऊतक 3 में मौजूद लोगों से कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं के प्रश्न बन गया है।

इस पांडुलिपि में, हम अग्रिमों बरकरार दिल में स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LFFM) तकनीक के प्रयोग से हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के ज्ञान में प्राप्त वर्णन है। LFFM फ्लोरोसेंट संकेतक का उपयोग करता है ऐसे साइटोसोलिक सीए 2, इंट्रा sarcoplasmic जालिका (एसआर) सीए 2 और झिल्ली क्षमता के रूप में कई शारीरिक चर को मापने के लिए। इन मापों एक साथ और संयोजन के रूप में वेंट्रिकुलर दबाव 9, 10, electrocardiograms 9, विद्युत कार्रवाई की क्षमता (ए पी एस), आयनिक वर्तमान रिकॉर्डिंग और बंदी यौगिकों 4 का फ्लैश photolysis, 11 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, इन मापों करीब उच्च आवृत्तियों पर बरकरार दिल पेसिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैशारीरिक दरों को आर। हालांकि कई लेख 9, 11, 12, 13, 14 हमारे समूह LFFM तकनीक का उपयोग करके प्रकाशित किया गया है, इस तकनीक के साथ जुड़े तकनीकी जटिलताओं का अनुमान दिल और अन्य अंगों में पूर्व vivo शारीरिक घटना के अध्ययन में इसका बड़े पैमाने पर उपयोग को रोका गया है।

LFFM तकनीक (चित्रा 1) ऊतक के साथ संपर्क में एक बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग कर प्राप्त epifluorescence माप के आधार पर किया जाता है। किसी भी संपर्क प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक की तरह, ऑप्टिकल संकल्प व्यास और फाइबर की संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पर निर्भर करता है। फाइबर का एक एनए उच्च और छोटे व्यास माप के स्थानिक संकल्प में वृद्धि होगी। NAS और फाइबर व्यास क्रमश: 0.22 से 0.66 के लिए और 50 माइक्रोन के लिए 1 से मिमी लेकर कर सकते हैं। मेंएनए बढ़ती एक बड़ा ठोस कोण से आ फोटॉनों को स्वीकार कर शोर अनुपात (एस / एन) के लिए संकेत सुधार होगा। आदेश में एक epifluorescence डिवाइस के रूप में कार्य करने के लिए, प्रकाश किरण एक एस्फेरिक लेंस या एक epifluorescence उद्देश्य के साथ ऑप्टिकल फाइबर में ध्यान केंद्रित किया है जहां लेंस के एनए और फाइबर मैच। इस मिलान उत्तेजना के लिए और फोटॉनों fluorophore द्वारा उत्सर्जित वापस इकट्ठा करने के लिए ऊर्जा हस्तांतरण अधिकतम हो।

आदेश बहिर्जात फ्लोरोसेंट संकेतक के ऊतकों में भरी हुई उत्तेजित करने के लिए, अलग तरह के प्रकाश स्रोतों और रोशनी मोड में उपयोग किया जा सकता है। हमारे अग्रणी स्पंदित स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 3, 12 (PLFFM) का उपयोग अध्ययन एक कम लागत पीकोसैकन्ड लेजर (चित्रा 1 ए, PLFFM) कार्यरत हैं। प्रकाश स्रोत के इस प्रकार के काफी हद तक कारण डाई विरंजन के बिना रोमांचक रोशनी क्षेत्र के अंतर्गत fluorophore अणुओं का एक बड़ा अंश का बहुत बड़ा फायदा हैछोटी नाड़ी के लिए 12 durations। इसके अतिरिक्त, ultrashort दालों का उपयोग डाई 12 के प्रतिदीप्ति जीवन भर के मूल्यांकन की अनुमति दी। प्रतिदीप्ति जीवन भर एक संपत्ति है कि सीए 2 के लिए बाध्य डाई अणु के अंश यों इस्तेमाल किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, नाड़ी करने वाली नाड़ी से दालों और आयाम में बदलाव के अस्थायी jittering मामलों को यह प्रयोगात्मक रणनीति जहां ligand डाई करने के लिए बाध्य द्वारा उत्पादित प्रतिदीप्ति में परिवर्तन बड़ी है के आवेदन की सीमा।

निरंतर तरंग (सीडब्ल्यू) लेज़रों आमतौर पर LFFM (चित्रा 1 बी, CLFFM) में मुख्य रोशनी स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। लेजर बीम लगातार ऊतक रोशन कर सकते हैं या ferroelectrically संग्राहक जा सकता है। किरण की ferroelectric मॉडुलन प्रकाश की microsecond दालों की पीढ़ी की अनुमति देता है। इस मॉडुलन बाहरी हार्डवेयर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। यह प्रक्रिया न केवल नाटकीय रूप से कम कर देता है टीवह प्रकाश दालों के अस्थायी jittering लेकिन यह भी मिश्रण अलग तरंग दैर्ध्य की कड़ियां अनुमति देता है। मुस्कराते हुए मिश्रण अलग लेज़रों से बहुसंकेतन किरणों द्वारा किया जाता है। एक परिणाम के रूप में, कई अलग अलग वर्णक्रमीय गुणों वाले रंगों उदाहरण के लिए, शारीरिक चर की एक किस्म की माप प्रदर्शन करने के लिए उत्साहित किया जा सकता है, Rhod-2 साइटोसोलिक सीए 2 के लिए, MagFluo4 इंट्रा-एसआर सीए 2 और di-8-ANEPPS के लिए के लिए झिल्ली क्षमता।

हालांकि LFFM में प्रकाश स्रोत के रूप में लेज़रों उपस्थित विभिन्न फायदे, प्रकाश स्रोतों के अन्य प्रकार के प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) सहित इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, उत्तेजना प्रकाश स्रोत एक InGaN एलईडी (चित्रा 1C, PLEDFM) शामिल थे। एल ई डी में, फोटॉनों अनायास उत्सर्जित कर रहे हैं जब चालन बैंड से इलेक्ट्रॉनों valence बैंड में छेद के साथ recombine। ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण के साथ अंतर यह है कि उत्सर्जन अन्य फोटॉनों से प्रेरित नहीं है। यह एक गैर-सुसंगत बीम में परिणाम औरएल ई डी के लिए एक व्यापक वर्णक्रम उत्सर्जन।

उच्च शक्ति एल ई डी के विभिन्न प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Di-8-ANEPPS और सीए के लिए उपयोग कर एपी रिकॉर्डिंग के लिए 2 + यात्रियों का उपयोग कर Fluo 4 या सदस्यता Fluo 4, हम एक एलईडी 485 एनएम (नीला) और 20 एनएम के एक आधी चौड़ाई में एक ठेठ चोटी उत्सर्जन है कि इस्तेमाल किया दर्ज की (चित्रा -1)। सीए 2 Rhod-2 के साथ दर्ज की गई यात्रियों के लिए, एलईडी 540 एनएम (हरा) और 35 एनएम (चित्रा -1) की एक आधा चौड़ाई में एक ठेठ चोटी उत्सर्जन था। एल ई डी एक बैंड तरंग दैर्ध्य में फेंकना और इसलिए उनके वर्णक्रमीय उत्सर्जन को संकीर्ण करने के लिए फिल्टर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, स्पंदित प्रकाश 20 μs की अवधि के साथ 1.6 किलो हर्ट्ज की दर से उत्पन्न किया जा सकता है। एल ई डी एक तेज शक्ति MOSFET क्षेत्र प्रभाव ट्रांजिस्टर के साथ स्पंदित कर रहे थे। विभिन्न संकेतकों के साथ एक साथ रिकॉर्डिंग समय-बहुसंकेतन एल ई डी द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, एल ई डी द्वारा उत्सर्जित प्रकाश एक लेजर बीम की तुलना में एक फाइबर ऑप्टिक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और अधिक कठिन है। इस प्रकार, हम में से मुख्य दोषआईएनजी एलईडी कि उनके उत्सर्जन प्रोफाइल मुख्य धुरी से कोणीय विस्थापन (± 15 °) है, और एक सहायक ऑप्टिक यह सही करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए है।

ऑप्टिकल विन्यास पहले से वर्णित के सभी में, उत्तेजना प्रकाश एक dichroic दर्पण की सहायता से परिलक्षित होता है। किरण बाद में एक एस्फेरिक लेंस और एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए एक बहुपद्वति फाइबर ऑप्टिक कि ऊतक पर तैनात है पर से ध्यान केंद्रित किया है। किसी भी epifluorescence व्यवस्था के रूप में, dichroic दर्पण भी उत्सर्जित प्रकाश से उत्तेजना अलग करने के लिए कार्य करता है। उत्सर्जित प्रकाश स्पेक्ट्रम एक बाधा फिल्टर के माध्यम से वापस यात्रा किसी भी परिलक्षित उत्तेजना हटा दें। अंत में, प्रकाश उत्सर्जित एक photodetector (चित्रा 1) पर एक उद्देश्य के साथ ध्यान केंद्रित किया है।

बिजली चालू करने के लिए प्रकाश से पारगमन सिलिकॉन हिमस्खलन photodiodes द्वारा किया जाता है। ये डायोड एक तेजी से प्रतिक्रिया और एक उच्च कम प्रकाश का पता लगाने की इजाजत दी संवेदनशीलता है।हिमस्खलन photodiodes द्वारा उत्पादित photocurrent दो तरह से परिलक्षित किया जा सकता है: एक transimpedance एम्पलीफायर एक प्रतिरोधक प्रतिक्रिया तत्व (चित्रा 1E) कर रहे हैं या एक जोड़नेवाला द्वारा एक वोल्टेज (चित्रा 1F) में वर्तमान में परिवर्तित करने के लिए। पहले दृष्टिकोण का प्रयोग, उत्पादन में वोल्टेज photocurrent और राय संघर्ष के लिए आनुपातिक है। पीकोसैकन्ड लेजर दालों की प्रतिरोधक का पता लगाने का एक विशिष्ट उदाहरण आंकड़े 2A, 2 बी और -2 सी में दिखाया गया है। पैनल 2A transimpedance एम्पलीफायर के उत्पादन को दिखाता है और पैनल 2 बी अंतराल तारांकित (*) के साथ संकेत का एक समय विस्तार से पता चलता है। एक चोटी ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाएं 12 के लिए शिखर (लाल) और बेस (हरा) का पता लगाने के लिए लागू किया गया था। आधार प्रतिदीप्ति की माप परिवेश निम्न आय वर्ग द्वारा शुरू हिमस्खलन photodiode के अंधेरे वर्तमान और हस्तक्षेप दोनों की जानकारी प्रदान करता हैहिंदुस्तान टाइम्स और विद्युत चुम्बकीय युग्मन। चोटियों और अड्डों में से एक प्रतिनिधित्व चित्र -2 सी में दिखाया गया है। यह आंकड़ा प्रतिदीप्ति डाई (Rhod-2) एक मार तोता दिल के हृदय चक्र के दौरान 2 + सीए के लिए बाध्य द्वारा उत्सर्जित को दिखाता है।

दूसरी विधि में, करनेवाला के उत्पादन में वोल्टेज वर्तमान और capacitive प्रतिक्रिया का एक समारोह है (आंकड़े 2 डी, 2 ई, और 2 एफ)। कोई बाहरी रोशनी के साथ पहली और एक स्पंदित एलईडी से एप्लाइड प्रकाश दालों के साथ दूसरा: चित्रा 2 एफ लगातार दो एकीकरण चक्र चलता। एक विस्तृत वर्णन आंकड़े 2 जी और 2 में प्रस्तुत किया है। यह दृष्टिकोण है, हालांकि अधिक श्रमसाध्य, प्रतिक्रिया संधारित्र में थर्मल शोर के अभाव के कारण एक बड़ा एस / एन प्रदान करता है। साधन एक समय मंच है कि सभी नियंत्रण और उत्तेजना प्रकाश की बहुसंकेतन उत्पन्न करता है और headstage एकीकरण और Res आदेशों शामिलएट समय। यह आमतौर पर एक डिजिटल सिग्नल प्रोसेसिंग सर्किट भी है कि डेटा की एक ऑन लाइन प्रतिगमन कंप्यूटिंग द्वारा एकीकृत उत्पादन में संकेत की एक डिजिटल भेदभाव करता है के साथ किया जाता है। एक प्रतिरोधक प्रतिक्रिया उपयोग करने के मामले में, किसी भी ए / डी अधिग्रहण बोर्ड का इस्तेमाल किया जा सकता है।

अंत में, हमारे LFFM तकनीक बहुत बहुमुखी है और एक से अधिक क्षेत्र से रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रकाश पथ में एक बीम फाड़नेवाला जोड़ने से हमें दो ऑप्टिकल फाइबर में प्रकाश को विभाजित करने की अनुमति देता है। प्रत्येक ऑप्टिकल फाइबर तो एक ऊतक करने के लिए स्वतंत्र रूप से, उत्तेजित और exogenous फ्लोरोसेंट जांच से रिकॉर्ड उत्सर्जन के विभिन्न क्षेत्रों पर रखा जा सकता है। इस संशोधन का आकलन करने के लिए कैसे शारीरिक क्षेत्रीय मतभेद शारीरिक चर को प्रभावित हमें अनुमति देता है। चित्रा 3 सीडब्ल्यू उत्तेजना प्रकाश ऐसी है कि दो ऑप्टिकल फाइबर transmural बिजली या intracellular को मापने के लिए उपयोग किया जाता है विभाजित करने के लिए नियोजित किया जा रहा एक बीम फाड़नेवाला चलता [सीए 2 +] स्तरों बुद्धिज नाबालिग-invasiveness। ट्रांसमुरल संकेतों अंतर्हृदकला पर एक फाइबर और वेंट्रिकुलर दीवार की epicardium परत पर अन्य रखकर दर्ज किया जा सकता है। इसलिए, LFFM तकनीक अलग-अलग क्षेत्रों में सेलुलर संकेतों के समय पाठ्यक्रम उपाय करने की क्षमता है और अगर क्षेत्रीय परिवर्तन रोग स्थितियों के अंतर्गत होने परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल और सभी चूहों से निपटने यूसी Merced संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (नं 2008-201) द्वारा अनुमोदित किया गया था। तोता प्रयोगों के साथ पशु उपयोग के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए वेनेजुएला के संस्थान (IVIC) के वैज्ञानिक आयोग द्वारा स्थापित के लिए सामान्य नीतियों के अनुसार 1999 में आयोजित की गई।

1. Langendorff सेट अप तैयारी

  1. 140 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl 2, 1 2 MgCl, 0.33 ना 2 HPO 4, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES: mm में निम्नलिखित घुला हुआ पदार्थ सांद्रता वाले Tyrode समाधान तैयार है। NaOH के साथ 7.4 Tyrode समाधान के पीएच को समायोजित करें और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर।
  2. 60 एमएल सीरिंज में Tyrode समाधान और क्षैतिज Langendorff के सभी ट्यूबिंग सेट-अप 11, 12 4 चित्र में सचित्र लोड। सभी हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. 2 के साथ संतुलित करना Tyrode समाधान।
    1. एक हे 2 टैंक के लिए प्लास्टिक टयूबिंग कनेक्ट।
    2. 60 मिलीलीटर सिरिंज में Tyrode समाधान में एक 5 "ट्यूब कम करने के लिए एक प्लास्टिक की टी एडाप्टर जोड़ें।
    3. 5 "ट्यूब के अंत करने के लिए एक प्लास्टिक की हवा पत्थर देते हैं तो हे 2 इच्छाशक्ति बुलबुला बाहर Tyrode समाधान में।
  4. एक गैर absorbable शल्य सीवन एक प्रवेशनी के रूप में इस्तेमाल एक सुई के चारों ओर रखें। सुई कई गुना (चित्रा 4 देखें) है कि अलग अलग समाधान के साथ रेट्रो-छिड़काव की अनुमति देता है के लिए युग्मित है। अंत में, दिल की महाधमनी सुई में cannulated दिया जाएगा।

2. पशु तैयारी और हार्ट विच्छेदन

  1. (वजन 20 ग्राम के पूर्व। माउस, 20 इकाइयों या 200 μL के साथ इंजेक्षन) के साथ हेपरिन वजन और इंजेक्षन माउस ग्रीवा अव्यवस्था से euthanizing से पहले 15 मिनट। असंवेदनता तोता अनुसार टीहे आपकी IACUC प्रोटोकॉल के पशु का उपयोग गाइड और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: 8 सप्ताह पुराने चूहों या 20 ग्राम तोता का प्रयोग करें।
  2. Euthanization के बाद वक्ष गुहा से दिल निकालें। के रूप में चूहों के लिए वर्णित ठीक उसी तरह तोता दिलों निकालें।
    1. इथेनॉल के साथ माउस छाती को साफ करें।
    2. विच्छेदन कैंची का प्रयोग, पेट के निचले हिस्से में एक चीरा बनाने के लिए और फिर गर्दन की ओर पक्षों को काट दिया।
    3. वापस खींचो कटौती ऊतक और यह नीचे पिन।
    4. डायाफ्राम कट। सावधान रहो, जब डायाफ्राम काटने दिल को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए।
    5. फेफड़े और आसपास के ऊतकों को निकालें।
    6. यह फैलाएंगे बिना दिल स्कूप करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। यथासंभव लंबे समय के महाधमनी में कटौती।
  3. लगभग 1 एमएल Tyrode समाधान के साथ एक छोटे से तौलना नाव पर दिल परिवहन।
  4. एक गैर absorbable शल्य सीवन का उपयोग, क्षैतिज Langendorff तंत्र पर महाधमनी टाई एक के माध्यम सेसुई। दो ठीक चिमटी की सहायता से दिल महाधमनी बाँधो। Tyrode समाधान युक्त 60 एमएल सीरिंज के साथ श्रृंखला में स्थित वाल्व खोलने के द्वारा रेट्रो-छिड़काव शुरू करते हैं।
  5. दिल 10 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें। रक्त और डाई लोड करने से पहले दिल के आसपास वसा ऊतकों को साफ करने के लिए इस समय का उपयोग करें। चिमटी के साथ दिल के आधार के पास वसा ऊतकों को खींचने के लिए और छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग काटा। एक विदारक माइक्रोस्कोप के देखने के तहत यह करने के लिए सुनिश्चित करें।

3. साइटोसोलिक सीए 2 माप: तैयारी डाई Rhod-2:00

  1. DMSO में 20% Pluronic के 20 μL (एक गैर-ईओण surfactant) डाई डाई की 50 ग्राम युक्त निर्माता द्वारा प्रदान की एक विशेष पैक प्लास्टिक की शीशी में जोड़े।
  2. ऊपर और नीचे pipetting बुलबुले से परहेज है, द्वारा मिक्स।
  3. गैर ईओण surfactant और एक स्पष्ट कांच की शीशी में विशेष पैक प्लास्टिक की शीशी से डाई के साथ मिश्रित DMSO स्थानांतरण। Tyrode समाधान के 1 एमएल जोड़ेंस्पष्ट कांच की शीशी को tion।
  4. एक स्नान sonicator में 15-20 मिनट के लिए Sonicate।
  5. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर डाई छिड़कना।
    1. डाई कक्ष में डाई रखें।
    2. कई गुना से जुड़े अन्य सभी ट्यूबिंग लाइनों सेक करने के लिए एक यांत्रिक दबाना का प्रयोग करें। दबाना कई गुना ऊपर रखा गया है। यह 60 एमएल सीरिंज से जुड़े ट्यूबिंग में किसी भी backflow को रोकने जाएगा।
    3. छिड़काव क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर बारी डाई घूम शुरू करने के लिए। इसके तत्काल बाद 60 मिलीलीटर सिरिंज से नीचे 3 तरह वाल्व बंद कर दें।
    4. एक छोटी ट्यूब कि सक्शन क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला दिल के बगल में पंप डाई कि दिल में भरकर रखा जा चुका है recirculate करने से जुड़ा है स्थिति।

4. इंट्रा-एसआर सीए 2 माप: तैयारी डाई सदस्यता Fluo4AM

  1. Rhod-02:00 के रूप में एक ही तरीके से सदस्यता Fluo4AM तैयार करें। कदम वार निर्देश के लिए धारा 3 का संदर्भ लें।
  2. afteआर डाई लोड, Tyrode समाधान युक्त रेट्रो-छिड़काव शुरू करने के लिए 60 एमएल सीरिंज के साथ श्रृंखला में स्थित वाल्व खुला। कई गुना ऊपर दबाना को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. क्षैतिज चैम्बर के लिए Tyrode समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म।
  4. 45 मिनट के लिए Tyrode समाधान के साथ रेट्रो-छिड़कना साइटोसोलिक डाई हटा दें।

5. झिल्ली क्षमता माप: तैयारी डाई di-8-ANEPPS

  1. 99% इथेनॉल के 5 एमएल डाई शीशी कि डाई के 5 मिलीग्राम शामिल करने के लिए जोड़ें।
  2. विभाज्य एक अपराधी के पिपेट का उपयोग कर 500 व्यक्ति 1 एमएल प्लास्टिक शीशियों में 10 μL।
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक गति निर्वात और दुकान में सूखना।
  4. सूखा डाई की 10 माइक्रोग्राम के साथ एक प्लास्टिक की शीशी को 20% से 20 μL Pluronic DMSO में जोड़ें।
  5. ऊपर और नीचे pipetting बुलबुले से परहेज है, द्वारा मिक्स।
  6. प्लास्टिक की शीशी से एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर (10 एमएल) के लिए Pluronic और डाई के साथ DMSO युक्त मिश्रण स्थानांतरण। एक अंतिम vo को Tyrode समाधान जोड़ें5 एमएल की Lume।
  7. एक स्नान sonicator में 20-25 मिनट के लिए Sonicate।
  8. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर 30 मिनट के लिए दिल में छिड़कना। धारा 3.5 में चरणबद्ध निर्देश देखें।

6। एपिकार्डियल संकेतों रिकॉर्डिंग

  1. डाई लोड करने के बाद, कई गुना ऊपर दबाना को हटाने के द्वारा Tyrode समाधान के साथ दिल रेट्रो-छिड़कना। Tyrode समाधान युक्त 60 मिलीलीटर सिरिंज के साथ श्रृंखला में स्थित वाल्व खोलें। 10 मिनट के लिए रेट्रो-छिड़कना Tyrode समाधान दिल को स्थिर करने के लिए।
  2. Tyrode समाधान के साथ क्षैतिज चैम्बर भरें और 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान स्नान लाने के लिए Peltier इकाई पर बारी।
  3. दिल की सतह पर फाइबर ऑप्टिक स्थिति।
    1. फाइबर ऑप्टिक एक 2 एमएल पिपेट अंदर प्लेस और फिर एक micromanipulator विंदुक देते हैं।
    2. micromanipulator का उपयोग थोड़ा एल.वी. की सतह के खिलाफ फाइबर ऑप्टिक प्रेस करने के लिए।
  4. बाह्य hea को गतिएक उत्तेजक एक लहर जनरेटर द्वारा नियंत्रित साथ RT।
    1. लहर जनरेटर कार्यक्रम 1 एमएस की चौड़ाई के साथ एक वर्ग पल्स प्रदान करने के लिए।
    2. उत्तेजक बाह्य सिंक्रनाइज़ करने के लिए सेट और लहर जनरेटर के लिए बाहरी इनपुट कनेक्ट।
    3. उत्तेजक के प्रत्येक उत्पादन करने के लिए, एक एक्यूपंक्चर सुई अंत में soldered के साथ एक तार को जोड़ने।
    4. दिल लगभग 3 मिमी एक दूसरे से अलग के शीर्ष में दोनों एक्यूपंक्चर सुइयों रखें।
    5. के बाद ही सुइयों के ऊतकों में रखा जाता है, बिजली के झटके को रोकने के लिए उत्तेजक के उत्पादन पर बारी।
  5. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, 10 किलोहर्ट्ज़ के लिए अधिग्रहण की आवृत्ति को समायोजित।

7। Endocardial संकेतों रिकॉर्डिंग

  1. कदम के लिए 6.1 और 6.2 डाई लोड करने के बाद दिल को स्थिर करने के लिए देखें।
  2. फाइबर ऑप्टिक के आकार के बारे में एक तेज 23Ga बिंदु का प्रयोग, पट पास एल.वी. में दिल की सतह में एक छोटा सा छेद करना।
    3. <li> अंतर्हृदकला में स्थिति पहले फाइबर ऑप्टिक एक micromanipulator का उपयोग करने में सहायता करने के लिए एक intravitreal सर्जरी sclerotomy एडाप्टर रखें।
  3. बाह्य दिल को गति। कदम के लिए 6.4 देखें।
  4. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, 10 किलोहर्ट्ज़ के लिए अधिग्रहण की आवृत्ति को समायोजित।

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Representative Results

एपी और सीए 2 अंतर्हृदकला और epicardium में यात्रियों

आदेश वेंट्रिकुलर दीवार के पार संकेतों की तुलना करने के लिए, एक फाइबर ऑप्टिक अंतर्हृदकला में तैनात और epicardium में अन्य है। एक एपी epicardium से एक के साथ अंतर्हृदकला से दर्ज की आकृति विज्ञान मुकाबले सबसे अच्छा तरीका है transmural समारोह का आकलन करने के लिए है। वेंट्रिकुलर दीवार बेहद विषम है और इस प्रकार, ए पी एस की आकृति विज्ञान इन दोनों क्षेत्रों में बहुत अलग हैं। यह सर्वविदित है कि अंतर्हृदकला कम है मैं करने के लिए epicardium 17, 18, 19 से अधिक है। कम मैं अंतर्हृदकला 18, 20 में 1 चरण में धीमी की repolarization बनाता है। चित्रा 5 ब शअंतर्हृदकला और epicardium से एपी के एक ठेठ ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग Ows। ये रिकॉर्डिंग करने के लिए, चूहों दिलों potentiometric डाई di-8-ANEPPS साथ भरी हुई थी और प्रतिदीप्ति CLFFM तकनीक का उपयोग मापा गया था। ऑप्टिकली दर्ज की गई एपी की आकृति विज्ञान, विशेष रूप से चरण 1 में, अंतर्हृदकला के लिए एक धीमी समय पाठ्यक्रम (कार्रवाई संभावित अवधि (APD) 30 ± 2.5 8.01 एमएस है) epicardium की तुलना में (± 0.59 3.4 एमएस) (चित्रा 5 ब) से पता चलता है। सामान्य तौर पर, APD समय यह 30, 70 या 90 (चित्रा 5 ए) सहित एक निश्चित प्रतिशत repolarize एपी लेता है के रूप में वर्णित किया जा सकता है। ये निशान सामान्यीकृत किया गया है और ओवरलैपिंग चरण 0. है की APDs की तुलना (चित्रा 5C) जब हम देखते हैं कि अंतर्हृदकला और epicardium हालांकि इन ए पी एस प्रतिदीप्ति संकेत हैं चरण 1 के दौरान काफी अलग हैं स्थानांतरित कर दिया, वे एक विशिष्ट करने के लिए calibrated किया जा सकता एक साथ एक साथ एपी को मापने के द्वारा झिल्ली क्षमतातेज 3 एम KCl 13 के साथ भरा microelectrode।

इसके अलावा संभावित झिल्ली के लिए में, बहिर्जात फ्लोरोसेंट संकेतक intracellular [सीए 2 +] की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आमतौर पर, हम Rhod-02:00 का उपयोग अपने उच्च गतिशील रेंज और यहां तक कि शारीरिक तापमान पर cytosol में रहने के लिए अपनी क्षमता की वजह से intracellular सीए 2 + यात्रियों को मापने के लिए। चित्रा 6B अंतर्हृदकला और epicardium परत में intracellular सीए 2 + यात्रियों का एक विशिष्ट रिकॉर्डिंग से पता चलता है। इन परिणामों के आंशिक रूप से प्रकाशित किया गया है 15। आदेश intracellular में क्षेत्रीय मतभेदों की तुलना करने में [सीए 2 +] स्तर, सीए 2 + यात्रियों के कैनेटीक्स (चित्रा 6A) का मूल्यांकन किया गया। कुल मिलाकर, सीए 2 क्षणिक कैनेटीक्स (चित्रा 6C) के विश्लेषण से पता चलता है कि अंतर्हृदकला से सीए 2 + यात्रियों महत्वपूर्ण थाepicardium से दर्ज की उन लोगों की तुलना में धीमी कैनेटीक्स बात यह।

एसआर लुमेन में सीए 2 गतिशीलता

दिल में, वृद्धि और intracellular के पतन [सीए 2 +] स्तरों दबाव, सिकुड़ना, और कार्रवाई संभावित अवधि (APD) सहित कई शारीरिक चर को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण हैं। पिछले अनुभाग साइटोसोलिक सीए 2 + यात्रियों को मापने के लिए हमारी क्षमता का वर्णन किया। सीए 2 एसआर से रिहा intracellular साइटोसोलिक सीए 2 में वृद्धि के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है। इस प्रकार, intracellular सीए में हर वृद्धि के लिए 2 + 2 + वहाँ एक सीए है एसआर में कमी। हालांकि, साइटोसोलिक सीए 2 + यात्रियों पूरी तरह एसआर सीए 2 रिलीज की वजह से नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से सेल में आने से सीए 2 शामिल हैं। हमारी प्रयोगशाला16 एक फ्लोरोसेंट रंजक, सदस्यता Fluo-04:00 के उपयोग के द्वारा एसआर सीए 2 सामग्री का मूल्यांकन करने में सक्षम हो गया है। हालांकि इस डाई myoplasm और एसआर में डी-esterified है, myocytes साइटोसोलिक अंश बाहर हटा सकते हैं। इस डाई बाहर निकालना बस 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में वृद्धि से पदोन्नत किया जा सकता है। इस तापमान पर, साइटोसोलिक डाई झिल्ली प्रोटीन की तरह एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट से निकाल दिया जाता है। सौभाग्य से, इस प्रोटीन एसआर झिल्ली में मौजूद नहीं है। इसलिए, 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में वृद्धि के बाद, प्रतिदीप्ति PLFFM तकनीक का उपयोग कर दर्ज ज्यादातर सीए 2 एसआर भीतर डाई करने के लिए बाध्य करने का एक परिणाम है। आदेश organelle माप की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, एक कैफीन पल्स RYR के माध्यम से सीए 2 रिहाई को प्रोत्साहित करने के लिए लागू किया गया था। यह देखने के लिए कि संकेत वास्तव में एसआर कमी (चित्रा 7) का परिणाम है संभव है। कैफीन प्रेरित एसआर सीए 2 रिलीज (चित्रा 7A(92 ± 0.05% (एन = 4, पी = 0.012)) दोनों सदस्यता Fluo 4 प्रतिदीप्ति की डायस्टोलिक स्तर में कमी का उत्पादन,) और सीए 2 + यात्रियों (51 ± 0.21% के आयाम में कमी (एन = 4, पी = 0.003)) 16। इंट्रा एसआर निशान से पहले दर्ज की गई और कैफीन प्रोत्साहन के बाद नीचे चित्रा 7b-7 दिन में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। समय कैफीन प्रोत्साहन से प्रगति के रूप में, एसआर कमी के आयाम छोटा होता है। चित्रा 7e दिखाता है कि एसआर कमी न केवल सीए 2 संकेत के आयाम में कमी लाती है लेकिन यह भी एसआर सीए 2 रिहाई की प्रक्रिया को धीमा कर देती। चित्रा 7A में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के पहले प्रकाशित किया गया है 15।

स्पंदित एलईडी: लड़ाई क्षमता

चित्रा 5 में हम पता चला कि डि-8-ANEPPS परिवर्तन रिपोर्ट कर सकते हैंझिल्ली क्षमता में जब यह 532 एनएम पर उत्साहित है। इस उत्तेजना शर्त के तहत, वहाँ तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की कमी आई 590 एनएम से अधिक है। दिलचस्प है, यह potentiometric डाई इसकी अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए उत्साहित बंद (~ 476 एनएम), कम तरंग दैर्ध्य जब झिल्ली depolarizes डाई पारियों की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन होता है जब। नतीजतन, इस वर्णक्रम पारी में दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करने के लिए हमें अनुमति देता है। इस वर्णक्रम संपत्ति di-8-ANEPPS दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य में दर्ज उत्सर्जित प्रतिदीप्ति, एक विशेषता यह महान मूल्य का आमतौर पर है कि क्योंकि अंतिम गणना रिकॉर्डिंग झिल्ली में डाई एकाग्रता की स्वतंत्र हो जाएगा की राशन की अनुमति देता है। आदेश di-8-ANEPPS वर्णक्रमीय पारी का पूरा फायदा उठाने के लिए, हम एक प्रकाश स्रोत के रूप में एल ई डी स्पंदित किया करते थे। हम fluorophore उत्तेजित करने के लिए स्पंदित नीले रंग की रोशनी का इस्तेमाल किया। उत्तेजना 485 एनएम, डि-8-ए के शिखर अवशोषण तरंग दैर्ध्य के करीब पर प्रदर्शन किया गया थाNEPPS (~ 476 एनएम)। दो अलग अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी बैंड में अधिग्रहण अनुपात गठन और एस / एन बढ़ाने के लिए और दिलों जहां यांत्रिक uncoupler blebbistatin इस्तेमाल नहीं किया गया करार में पर्यावरण प्रकाश और गति विरूपण साक्ष्य की तरह आम मोड शोर को अस्वीकार करने की क्षमता देता है। इस स्थिति में प्रयोगात्मक शर्तों जहां दोनों के दिल की यांत्रिक गतिविधि और सीए 2 + यात्रियों के कैनेटीक्स एक साथ मापा जा करने की आवश्यकता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

PLEDFM के समय आरेख चित्रा 8A में सचित्र है। आरेख एकीकरण और photodetection headstage, एलईडी के पर बंद समय और एनालॉग से डिजिटल रूपांतरण के रीसेट के लिए नियंत्रण तर्क भी शामिल है। एक एपी के समय पाठ्यक्रम के दौरान, प्रतिदीप्ति हरे रंग तरंग दैर्ध्य बैंड में पता चला तीव्रता में वृद्धि हुई है, जबकि प्रतिदीप्ति लाल बैंड में पता चला कम हो जाती है पता चलता है। 8b शो चित्राकि प्रतिदीप्ति संकेत झिल्ली विध्रुवण द्वारा उत्पादित के परिवर्तन के अलग अलग दिशाओं में ले जाता है। हालांकि, इस प्रस्ताव का दिल संकुचन द्वारा उत्पादित विरूपण साक्ष्य हमेशा एक ही दिशा में उन्मुख है, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के स्वतंत्र। जैसा कि पहले बताया गया है, दोनों चैनलों (हरे और लाल) के डेटा सॉफ्टवेयर वातानुकूलित अनुपात की गणना से पहले किया जाना चाहिए। कंडीशनिंग ऑफसेट और सुधार हासिल करना शामिल है। ऑफसेट और लाभ के स्तर सुधार के चयन स्वत: नहीं है। सॉफ्टवेयर के उपयोगकर्ता अनुपात से पहले निशान हालत चर का चयन किया है। पैनल 8b में जिसके परिणामस्वरूप अनुपात (8 चित्रा) से पता चलता है कि विरूपण साक्ष्य दौरे आंदोलन द्वारा पेश रद्द कर दिया है।

एक एपी के दौरान di-8-ANEPPS प्रतिदीप्ति के रिश्तेदार परिवर्तन आमतौर पर बहुत छोटा है (~ 8% 100 एम वी प्रति)। यह di-8-ANEPPS प्रतिदीप्ति परिवर्तन सीए 2 bindin द्वारा उत्पादित एक से बहुत छोटा होता हैRhod -2 (<200%) करने के लिए जी। इस प्रकार, क्रम di-8-ANEPPS के शोर अनुपात करने के लिए संकेत को बढ़ाने के लिए, कई रिकॉर्डिंग औसतन किया जा सकता है।

स्पंदित एलईडी: सीए का एक साथ रिकॉर्डिंग और झिल्ली क्षमता 2+

इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर अंतिम लक्ष्य सीए 2 + यात्रियों और ए पी एस के एक साथ रिकॉर्डिंग प्रदर्शन में होते हैं। ऑप्टिकल फाइबर के साथ प्रकाश स्रोत युग्मन, एल ई डी के उत्सर्जन के साथ डाई के अवशोषण स्पेक्ट्रम मिलान करने के लिए, एनालॉग और डिजिटल इलेक्ट्रॉनिक सर्किट डिजाइन: कई शारीरिक संकेतों के साथ रिकॉर्डिंग सहित प्रणाली के विभिन्न पहलुओं से संबंधित तकनीकी कठिनाइयों को हल करने की आवश्यकता होती है समय और अधिग्रहण के साथ ही तेजी से सॉफ्टवेयर के विकास पर लाइन डेटा का विश्लेषण करने के लिए उत्पन्न करते हैं।

कहां मेंआर अध्ययन, रंगों का चयन उनकी वर्णक्रमीय विशेषताओं पर निर्भर करता था। विविध संकेतों को मापने के लिए इस्तेमाल किया flourophores अलग वर्णक्रम बैंड में अवशोषित चाहिए। इस हालत संकेत स्रोतों के बीच भेद करने के लिए आवश्यक है। हर बार है कि एक एलईडी एक अलग तरंग दैर्ध्य होने के ऊतकों को उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रतिदीप्ति डाई कि उस तरंग दैर्ध्य में अवशोषण के साथ संबंधित संकेत से मेल खाती का पता चला। इस तरह, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन विभिन्न रंगों से आ रहा है, लेकिन एक ही तरंग दैर्ध्य बैंड में, जो समय पर हर एक को उत्साहित है द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

फिर भी, डाई स्पेक्ट्रम के बीच crosstalk को पूरी तरह से टाला नहीं जा सकता। इसका कारण यह है रंगों का वर्णक्रम अवशोषण विशेषताओं उन्हें अपने चरम अवशोषण से दूर तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश को अवशोषित करते हैं। हमारे प्रयोगों में, crosstalk दोनों तरीकों में पेश किया गया: (1) Rhod -2 नीले एलईडी से उत्साहित किया जा रहा है, लाल channe करने के लिए एक सीए 2 संकेत जोड़नेएल एपी का पता लगाने, और (2) डि-8-ANEPPS हरी एलईडी, जो सीए 2 क्षणिक संकेत (चित्रा 9 फ) पर दिखाई देता से उत्साहित किया जा रहा। इस crosstalk, ऑन लाइन सुधारा जा सकता है के रूप में 9 चित्रा में सचित्र। प्रक्रिया काम करता है क्योंकि घुसपैठ के संकेत संकेत मापा जा करने की जरूरत है कि एक छोटा सा प्रतिशत है। अंत में, रंगों से हमें एपी (चित्रा 9d) को अलग करने के लिए अनुमति दी fluorecence बीजीय प्रसंस्करण के इस प्रकार का उपयोग कर के रूप में सीए 2 + यात्रियों (चित्रा 9h)। इस प्रसंस्करण की एक विस्तृत रूपरेखा आंकड़ा कथा में वर्णित है। यह सूचना है कि सभी स्पंदित एलईडी प्रयोगों एक 28 डिग्री सेल्सियस प्रदर्शन किया गया महत्वपूर्ण है।

आकृति 1
चित्रा 1: स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LFFM)। LFFM एक epifluorescence व्यवस्था के होते हैंएक बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर ऊतक के साथ संपर्क में है कि का उपयोग कर प्रतिदीप्ति दिल में भरकर रखा बहिर्जात रंगों से उत्सर्जित रिकॉर्ड करने के लिए। LFFM सेट-अप सहित (क) PLFFM, जहां उत्तेजना प्रकाश एक स्पंदित पिको एन डी Yag लेजर द्वारा प्रदान की जाती है तीन अलग तरह के प्रकाश स्रोतों का उपयोग कर सकते हैं; (ख) CLFFM, जहां निरंतर तरंग लेज़रों इस्तेमाल कर रहे हैं और प्रकाश दालों एक ferroelectric न्यूनाधिक अलग तरंग दैर्ध्य के साथ लेज़रों के बहुसंकेतन की अनुमति देकर उत्पन्न कर रहे हैं; और (ग) PLEDFM, जहां एल ई डी के शिखर उत्सर्जन (घ) 485 एनएम और नीले और हरे रंग एल ई डी के लिए 540 एनएम के साथ व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम रहा है, क्रमशः, इलेक्ट्रॉनिक स्पंदित कर रहे हैं। जब लेजर सूत्रों उपयोग किया जाता है, किरण एक किरण विस्तारक द्वारा defocused है। अंत में, dichroic दर्पण और उद्देश्य लेंस फाइबर ऑप्टिक के बाहर का अंत जो थोड़ा ऊतक के खिलाफ दबाया जाता है पर बीम ध्यान केंद्रित। प्रकाश उत्सर्जित एक ही ऑप्टिक फाइबर के माध्यम से वापस यात्रा, dichroic दर्पण, ईएमआईssion फिल्टर, और एक हिमस्खलन photodiode जहां फोटॉनों एक विद्युत प्रवाह में परिवर्तित कर रहे हैं पर केंद्रित है। वर्तमान में दो तरीकों (ई) transimpedance एम्पलीफायर, जहां परिणामस्वरूप उत्पादन में वोल्टेज photocurrent और राय संघर्ष के लिए आनुपातिक है से परिलक्षित किया जा सकता है; (च) करनेवाला है, जहां उत्पादन में वोल्टेज वर्तमान और capacitive प्रतिक्रिया का एक समारोह है। अंत में, एक संकेत ए / डी कनवर्टर से हासिल कर लिया और एक कंप्यूटर पर देखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रतिरोधी और capacitive रूपांतरण। (क) पीकोसैकन्ड लेजर दालों की प्रतिरोधक का पता लगाने का एक विशिष्ट उदाहरण दिखाया गया है। तारांकित (ख)एक समय का विस्तार अंतराल है, जहां एक चोटी ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म शिखर (लाल) और बेस (हरा) का पता लगाने के लिए लागू किया गया था पता चलता है। (ग) चोटियों और ठिकानों रिकॉर्डिंग से गणना निशान की एक प्रतिनिधित्व 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक मार तोता दिल में Rhod-2 फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं बाहर से 7 हर्ट्ज पर पुस्तक है और स्नान तापमान के लिए दिखाया गया है। एच डी) photocurrent एक जोड़नेवाला एक capacitive प्रतिक्रिया का उपयोग करके बदल दिया। बरकरार माउस दिल सीए 2 + यात्रियों की विशिष्ट रिकॉर्डिंग दो अलग अलग समय तराजू (डी और ई) में दिखाया जाता है। (च) के साथ और एलईडी रोशनी के बिना लगातार दो चक्र का एकीकरण दिखाए जाते हैं। संकेत बढ़ जाती है की अभिन्न photocurrent प्रतिक्रिया संधारित्र शुल्क रैखिक के रूप में। समय निर्भर अभिन्न (टैन (Ɵ)) की ढलान पी द्वारा प्रेरित इलेक्ट्रॉन छेद पुनर्संयोजन के अलावा हिमस्खलन जंक्शन को प्रभावित फोटॉनों की संख्या के अनुपात में होती हैhononic गतिविधि जब हिमस्खलन डायोड किसी भी फोटॉनों पता नहीं लगा। डिजिटल संकेतों headstage एकीकरण को नियंत्रित करने और रीसेट अवधि पैनल ग्राम में दिखाए जाते हैं। गैर-रोशन (डीसी) और एलईडी रोशन अवधि (एफ) के दौरान पता चला संकेतों में पैनल ज दिखाए जाते हैं। एफ और डीसी के घटाव fluorescently की वास्तविक माप का पता चला चूहों दिल से सीए 2 + यात्रियों बाहर से 37 डिग्री सेल्सियस (ज) में 9 हर्ट्ज पर पुस्तक प्रदान करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: epicardium और अंतर्हृदकला माप के लिए LFFM। CLFFM सेट-अप प्रतिदीप्ति बहिर्जात फ्लोरोसेंट epicardium एक में मौजूद रंगों से उत्सर्जित को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया थाडी अंतर्हृदकला परतें। एक बीम फाड़नेवाला के अलावा epicardium और अंतर्हृदकला में विभिन्न शारीरिक चर की रिकॉर्डिंग की। दो फाइबर ऑप्टिक्स अपनी व्यक्तिगत headstages के साथ इस्तेमाल किया गया epicardium और अंतर्हृदकला से पता लगाने के लिए। एक छोटे परिपत्र चीरा वेंट्रिकल में बनाया गया था और एक फाइबर ऑप्टिक अंतर्हृदकला से रिकॉर्ड करने के लिए के माध्यम से पिरोया गया था। यह सेट-अप एक प्रतिरोधक प्रतिक्रिया के साथ एक वर्तमान से वोल्टेज कनवर्टर के लिए इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: तापमान नियंत्रण के साथ क्षैतिज चैंबर। एक चित्र Langendorff सेट-अप जहां बरकरार दिलों घंटे के लिए कार्यात्मक रखा जाता है दिखा। दिल एक सुई से जुड़ा हुआ है जो सभी समाधान और रंगों के माध्यम सेcoronaries महाधमनी से शाखाओं में बंटी के माध्यम से दिल में रेट्रो-भरकर रखा जाता है। चैम्बर एक Peltier यूनिट से ऊपर तैनात है स्नान है, जो एक वोल्टमीटर से जुड़े एक तापमान संवेदक द्वारा पढ़ा जाता है के तापमान को बनाए रखने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: बरकरार दिल में ट्रांसमुरल कार्रवाई संभावित माप। (क) संभावित कार्रवाई अवधि (APD) समय यह 30%, 70%, या एपी repolarization के 90% पूरा करने के लिए ले जाता है के रूप में मूल्यांकन किया है। (ख) epicardium (काला) और अंतर्हृदकला (ग्रे) से Di-8-ANEPPS प्रतिदीप्ति एपी वेंट्रिकुलर दीवार की दो परतों के बीच repolarization में रूपात्मक मतभेद दिखा। (ग) टी आकलन करने के बादवह 30, 70, और अंतर्हृदकला और epicardium में 90 APD, परिणाम केवल महत्वपूर्ण मतभेद APD 30 (8 ± 2.5 एमएस अंतर्हृदकला बनाम 3 ± 0.6 एमएस epicardium) में हुआ दिखाया। दिल 6 हर्ट्ज पर पुस्तक रहे थे और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। डेटा मतलब 5 दिलों की ± SEM हैं। * पी <0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: ट्रांसमुरल सीए 2 बरकरार दिल में क्षणिक माप। (क) सीए के पैरामीटर्स 2 + क्षणिक कैनेटीक्स मापा हैं: समय लेता है, अधिकतम तक पहुँचने के समय चोटी (टीपी) के लिए; समय यह 10% से वृद्धि का 90% करने के लिए जाने के लिए लेता है, समय (आरटी) वृद्धि; समय यह 10% से क्षय, क्षय समय (डीटी) के 90% करने के लिए जाने के लिए लेता है; और यहसमय यह क्षणिक, आधा अवधि (एचडी) के 50% पूरा करने के लिए लेता है। (ख) प्रतिदीप्ति एक हरे रंग की सीडब्ल्यू लेजर शो epicardium (काला) और विश्राम में मतभेदों के साथ अंतर्हृदकला (ग्रे) सीए 2 + यात्रियों के साथ उत्तेजना के बाद Rhod 2 द्वारा उत्सर्जित। ग) सीए अंतर्हृदकला से 2 + यात्रियों में आर टी, टी.पी., एच.डी. काफी धीमी कैनेटीक्स था, और epicardium से दर्ज की उन लोगों की तुलना डीटी। दिल 6 हर्ट्ज पर पुस्तक रहे थे और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। डेटा मतलब 5 दिलों की ± SEM हैं। * पी <0.05। Mattiazzi एट अल से संशोधित। 15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: इंट्रा एसआर सीए 2 बरकरार दिल में माप।(क) सदस्यता Fluo 4 डाई से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति इंट्रा एसआर सीए 2 एकाग्रता में कमी को दर्शाती है, समय के साथ चला जाता है। (ख) सदस्यता Fluo 4 प्रतिदीप्ति में कमी का संकेत सीए 2 + 2 + कमी सीए एसआर से रिहाई से प्रेरित का विस्तृत दृश्य। (ग) सदस्यता Fluo 4 प्रतिदीप्ति से क्षणिक आयाम में कमी 2 + सीए का प्रतिनिधित्व रिहाई 20 मिमी कैफीन के साथ दिल perfusing द्वारा संशोधित की एक विस्तृत दृश्य। (घ) कैफीन की एक लंबी आवेदन, दोनों सदस्यता Fluo 4 प्रतिदीप्ति की और सीए 2 + यात्रियों [नीचे 92 ± 0.05% (एन = 4, पी = 0.012) करने के लिए और के आयाम में डायस्टोलिक स्तर में कमी के बाद 51 ± 0.21% (एन = 4, पी = 0.003) प्रारंभिक मूल्यों का क्रमश:], मनाया जाता है। अधिक समय से कैफीन की प्रगति, छोटे एसआर कमी के आयाम है। (ई) बी में सामान्यीकृत निशान से पता चलता है कि एसआर कमी ही प्रेरित नहींएस सीए 2 संकेत के कम हो जाती है, लेकिन यह भी नीचे एसआर सीए 2 पुनःपूर्ति धीमा कर देती है। दिल 4 हर्ट्ज पर पुस्तक रहे थे और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। प्रतिदीप्ति का पता लगाने Kornyeyev एट अल से है। 16। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: स्पंदित एलईडी के साथ बरकरार दिलों में ए पी एस के ratiometric माप। (क) के एकीकरण और headstage के रीसेट सहित समय आरेख, पर बंद एलईडी और एक वास्तविक रिकॉर्डिंग के समय यह साफ है। (ख) निशान दो चैनलों से अलग आराम मूल्यों और ऑफसेट तक प्रत्येक एपी एक आराम मूल्य से पहले है लीवर ले जाकर सही है। प्रत्येक चैनल का लाभ भी adjus हैटेड। ध्यान दें कि एक बहुत बड़ा गति विरूपण साक्ष्य दो depolarizations के बीच दोनों चैनलों पर दिखाई देता है। सॉफ्टवेयर संकेतों ratiometrically प्रक्रियाओं के बाद, परिणाम ध्यान देने योग्य कलाकृतियों (नीला) के बिना एक एपी है। दिल 3 हर्ट्ज पर पुस्तक रहे थे और तापमान 28 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। सभी दिखाए रिकॉर्ड 10 निशान के एक औसत रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
9 चित्रा: एक साथ सीए 2 + यात्रियों और स्पंदित एलईडी के साथ बरकरार दिल में एपी माप। रिकॉर्डिंग के संकेतों के पार बात संदूषण जब दोनों सीए 2 और एपी ऑन-लाइन सुधारा जा सकता है। Potentiometric डाई, डि-8-ANEPPS, 20 μs के साथ उत्साहित है नीले एलईडी दालों (क)। सिग्नल एस रहे हैंplit, bandpass लाल और हरे रंग फिल्टर के साथ फ़िल्टर। इन संकेतों को लाल (ख) और ग्रीन चैनल (ग) के रूप में संकेत दो अलग हिमस्खलन photodiodes से पता चला रहे हैं। यह देखने के लिए कि दोनों का संकेत है, लाल और हरे रंग की, एक नजर आंदोलन विरूपण साक्ष्य है कि एक नीचे विक्षेपन के रूप में प्रकट पेश संभव है। दोनों का संकेत है, लाल और हरे रंग, offseted रहे हैं और फिर प्रवर्धित। वातानुकूलित संकेतों उन दोनों के बीच अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और परिणाम के विकास में दिखाया गया है। यह देखने के लिए कि दोनों संकेतों (घ) चलती कलाकृतियों रद्द कर रहे हैं के बीच अनुपात में संभव है। पैनल ई तर्क दालों है कि नियंत्रण एक हरे रंग की उत्सर्जक एलईडी सीए 2 + सूचक Rhod-2 को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल के अनुक्रम को दिखाता है। इस प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त फ्लोरोसेंट संकेत च में दिखाए जाते हैं। हालांकि एफ में ट्रेस ज्यादातर सीए 2 bindin के कारण प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि का पता चलता हैRhod-2 जी, यह भी संभव ट्रेस में एक नकारात्मक विक्षेपन निरीक्षण करने के लिए Di-8-ANEPPS से एक fluorescently पता लगाया संकेत जब इस डाई हरी बत्ती के साथ उत्साहित है के कारण है। यह समस्या जी में दिखाया गया potentiometric संकेत घटाकर द्वारा सुधारा जा सकता है। घटाव के परिणाम में पैनल ज जहां एक सीए दिखाया गया है 2+ मुफ्त सिग्नल की एक एपी संदूषण प्राप्त की है। दिल 3 हर्ट्ज पर पुस्तक रहे थे और तापमान 28 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। सभी दिखाए रिकॉर्ड 10 निशान के एक औसत रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पत्र स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति तकनीकों का वर्णन हृदय myocytes पूर्व vivo के समारोह का मूल्यांकन करने में केंद्रित है। एक युग्मित वातावरण में इन कोशिकाओं के अध्ययन से न केवल अधिक शारीरिक है, लेकिन यह भी अंग-स्तर विकृतियों का आकलन करने के लिए बेहद उपयुक्त है। सेलुलर अंतर्निहित उत्तेजना संकुचन युग्मन (ईसीसी) की घटनाओं आणविक जांच कि intracellular सीए 2 + गतिशीलता की निगरानी के उपयोग के साथ पूरे अंग स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है (Rhod 2 साइटोसोलिक सीए 2, सदस्यता Fluo4 एसआर सीए 2) और बिजली की गतिविधि (डीआई-8-ANEPPS)। यहाँ, हम तीन LFFM epifluorescence तकनीक है कि दोनों उत्तेजित और ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग फ्लोरोसेंट संकेतक से उत्सर्जन इकट्ठा प्रस्तुत किया है। उन्होंने इसका इस्तेमाल प्रकाश स्रोत और प्रकाश मॉडुलन के प्रकार के आधार पर अलग। PLFFM, एक लेजर कि दालों प्रकाश, CLFFM निरंतर लेजर प्रकाश का उपयोग करता है, जबकि LEDFM एल ई डी भी है कि PLEDFM में स्पंदित किया जा सकता का उपयोग करता है। ये सभीएक सेट के रूप में चित्र 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं, लेकिन तीन epifluorescence व्यवस्था का केवल एक ही साथ निर्माण किया जा सकता है। इसके अलावा, पता चला प्रकाश अलग अलग तरीकों से कार्रवाई की जा सकती। उदाहरण के लिए, चित्रा 2, जिसमें photocurrent या तो एकीकृत या सीधे एक वर्तमान से वोल्टेज कनवर्टर के माध्यम से एक वोल्टेज के लिए परिवर्तित किया जा सकता है दो अलग अलग स्थितियों को दिखाता है। सामान्य तौर पर, LFFM दृष्टिकोण के रूप में चित्रा 3 के लिए देखा है, एक साथ कई संरचनात्मक साइटों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यहाँ बरकरार अंग स्तर पर हृदय गुण का आकलन करने के लिए प्रस्तुत विधि अधिक समस्याओं जो कोशिकाओं के बीच युग्मन के ऊतकों के व्यवहार को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण है अध्ययन करने के लिए पर्याप्त है। दिल की आंतरिक विविधता अलग एपी उत्पादन कर सकते हैं 13 तरंग, 21, 22 विशिष्ट ऊतक के आधार पर जो सीई सेlls उत्पन्न। इसलिए, पूरे अंग पढ़ाई के विभिन्न शारीरिक संरचनाओं में सेल के स्थानीय शारीरिक समारोह का आकलन करने का अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हमने देखा है कि स्पार्क्स और लहरों की तरह intracellular घटनाओं बरकरार अंग 15 में से अलग कोशिकाओं में विभिन्न कैनेटीक्स है।

Langendorff सेट-अप (चित्रा 4) एक स्थिति है कि इन विवो के करीब है में दिल को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह कई दवाओं और विभिन्न फ्लोरोसेंट आणविक जांच कि कई शारीरिक चर की माप की अनुमति के retroperfusion अनुमति देता है। का इस्तेमाल किया, बहिर्जात फ्लोरोसेंट जांच बदलने फाइबर ऑप्टिक के आकार में वृद्धि, या चयन एक अलग तरह के प्रकाश स्रोत नाटकीय रूप से तकनीक के आवेदन को बदल सकते हैं। इसके अतिरिक्त, क्षैतिज चैम्बर नीचे Peltier इकाई विभिन्न तापमान पर सीए 2 गतिशीलता के अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं। सामान जोड़नेऐसे LFFM के रूप में एक beamsplitter बरकरार दिल में विभिन्न क्षेत्रों से रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया फाइबर ऑप्टिक्स की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं। यह अगर क्षेत्रीय मतभेद रोग स्थितियों में पाए जाते हैं परीक्षण करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी रूपांतर है। चित्रा 3 अंतर्हृदकला पता चलता है और एक साथ epicardium का आकलन किया जा रहा है। इसके अलावा, विभिन्न एगोनिस्ट के साथ दिल perfusing हमें समझने के लिए कैसे वेंट्रिकुलर दीवार के पार विभिन्न क्षेत्रों विनियमित रहे हैं अनुमति देता है। बिजली संकेतन (चित्रा 5) और सीए 2 गतिज (चित्रा 6) विषमताओं epicardium और अंतर्हृदकला पर तुलना की जा सकती। इसके अलावा, विभिन्न उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और उत्सर्जन फिल्टर के साथ कई रंगों का इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सदस्यता Fluo 4 का उपयोग करके, एसआर के लुमेन में सीए 2 स्तर (चित्रा 7) दर्ज किया जा सकता है। फाइबर ऑप्टिक का आकार अलग-अलग भी एक Lar से फ्लोरोसेंट रिकॉर्डिंग की अनुमति देकर इस विधि की क्षमता का विस्तार कर सकते हैंजीईआर क्षेत्र।

इस पत्र में भी पता चलता है कि एक तरफ महंगा पराबैंगनीकिरण से, एल ई डी हमारी तकनीक में एक उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। 8 चित्रा से पता चलता है कि प्रकाश स्रोत के इस प्रकार सस्ती ratiometrically प्राधिकृत व्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Ratiometric चित्रा 8 में दिखाया माप आंदोलन की वजह से उन सहित प्रयोगात्मक कलाकृतियों के बिना एक अंतिम रिकॉर्डिंग का निर्माण करने में फायदेमंद है। अंत में, यहां तक कि सीए 2 क्षणिक और एपी ऑप्टिकली दर्ज किया जा सकता है, एक साथ, बहुसंकेतन अलग तरंग दैर्ध्य और एक ही उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ रंगों का उपयोग करके। 9 चित्रा में उल्लिखित संकेतों के प्रसंस्करण रंगों के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में ओवरलैप द्वारा उत्पादित आंतरिक प्रदूषण को दूर करने में महत्वपूर्ण है। रिकॉर्डिंग सीए 2 + यात्रियों और ए पी एस, एक साथ, लेकिन स्वतंत्र उत्पादन संकेत के रूप में दो ईसीसी और सीए 2 प्रेरित सीए का अध्ययन करने में लाभकारी है 2+

LFFM बरकरार ऊतकों के सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान में कई अनुप्रयोगों के साथ एक तकनीक है। हालांकि, एक प्रमुख सीमा है कि दर्ज प्रतिदीप्ति स्थानीय क्षेत्र है जहां ऑप्टिकल फाइबर ऊतक के साथ संपर्क में है, में अंतर्निहित फ्लोरोसेंट संकेतक से उत्सर्जन के एक औसत है। यहां तक ​​कि जब दो फाइबर ऑप्टिक्स का उपयोग कर, LFFM मापा संकेतों के एक subcellular स्थानिक वितरण प्रदान नहीं करता है। ऑप्टिकल मानचित्रण शारीरिक चर है कि इस तरह एपी, सीए 2 + यात्रियों के प्रसार के रूप में अंतरिक्ष और समय में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक बेहतर तकनीक है, और alternans 23, 24, 25। LFFM भी संरचनाओं की इमेजिंग प्रदान करने के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी और अन्य ऑप्टिकल मानचित्रण तकनीक की तरह असमर्थ है। फिर भी, फाइबर ऑप्टिक्स के अपने प्रयोग यह अनुसंधान में व्यावहारिक बनाता हैअंतर्हृदकला या अन्य क्षेत्रों है कि एक confocal खुर्दबीन के साथ एक अक्षुण्ण दिल में उपयोग करने के लिए मुश्किल या असंभव है से स्थानीय प्रतिदीप्ति संकेतों ecording।

बरकरार दिल से प्राप्त शारीरिक चर के बीच और पृथक myocyte प्रयोगों से तुलना चुनौतीपूर्ण है। पृथक हृदय myocytes का उपयोग करने का सबसे बड़ा लाभ यह पैच दबाना की शर्तों के तहत कोशिकाओं के biophysical गुणों का मूल्यांकन करने के लिए अनूठा अवसर है। इसके विपरीत, LFFM एक अधिक देशी वातावरण में शारीरिक और रोग की घटना के अध्ययन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, अक्षत दिलों में हम transmural मतभेद 15, एपी और सीए के दिल दर निर्भरता 2 + शारीरिक पर पर्वतमाला 13 कि अलग कक्षों में अप्राप्य हैं आकलन कर सकते हैं। इसके अलावा, हम बरकरार दिल 9, 10 के समारोह पर एक इस्कीमिक अपमान के प्रभाव का अध्ययन कर सकते हैं। पूरे दिल पूर्वperiments भी हमें अन्य प्रकार की कोशिकाओं और myocytes 11 के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं।

LFFM बरकरार दिल के स्तर में जो कोशिकाओं शारीरिक युग्मन है पर सेलुलर संकेतों के दृश्य की अनुमति देता। LFFM intracellular गतिविधि के अध्ययन की अनुमति देता है, जबकि कोशिकाओं को बरकरार अंग में अभी भी कर रहे हैं। सीए 2 गतिशीलता और बिजली की गतिविधि: फ्लोरोसेंट रंगों और epiluminescence साथ संयोजन में, LFFM दो प्रमुख हृदय गुण निगरानी कर सकते हैं।

अंत में, यहाँ प्रस्तुत विधि ईसीसी के अध्ययन में कई आवेदन किया है सकते हैं। यह एक उपकरण का पता चलता है कि कैसे supramolecular संकेतों ऐसे arrhythmias 16 और ischemia 9, 15 के रूप में रोग की स्थिति में प्रभावित हो रहा है। इस तकनीक के बाद से वे केवल बरकरार अंग स्तर पर समझा जा सकता है इन विकृतियों का अध्ययन करने के लिए बहुत जरूरी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रस्तुत काम की महत्वपूर्ण चर्चा के लिए डॉ एलिसिया Mattiazzi धन्यवाद। यह काम एनआईएच से अनुदान द्वारा (R01 एच एल-084487) शराब के लिए समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma 7647-14-5
D-(+)-glucose Sigma 50-99-7
Potassium chloride Sigma 7447-40-7
HEPES Sigma 7365-45-9
Sodium phosphate Sigma 10049-21-5
Calcium chloride solution Sigma 10043-52-4
Magnesium chloride solution Sigma 7786-30-3
Sodium hyrdoxide Sigma S-8045
0.2 μm nylon membrane filter Whatman 7402-004
Manifold MPP Warner 64-0216 
21G1.5 Precision glide needle B-D 305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) AllMech Tech LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL AllMech Tech NDC63323-540-11
DMSO D8779 Sigma 67-68-5
Blebbistatin Sigma 856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution Biotium 59004
Materflex C/L peristaltic pump Cole-Parmer 77122-26
Isostim stimulator World Precision Instruments A320RC
Waveform generator Teledyne Lecroy WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20 Fisher Scientific 1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" Component Supply TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" Component Supply TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve Cole-Parmer EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings Cole-Parmer 6365-90
Plastic clamp WaterZoo 2465
Peltier TE Technology TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM ThermoFisher Scientific R1245MP
Di-8-ANEPPS ThermoFisher Scientific D3167
Mag-Fluo-4AM ThermoFisher Scientific M14206
Acupunture needles LHASA TC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lok Fisher Scientific 14-820-11
LabView National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge Fisher Scientific 07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320 Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nm ThorLabs DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective Edmund Optics Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective Edmund Optics Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm  ThorLabs FGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laser Siskiyou MX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 ThorLabs FT200UMT
LEDs blue Lumileds L135-B475003500000
LEDs green Lumileds L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing ThorLabs BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail Edmund Optics 54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier Edmund Optics 54-404
0.75" Travel, micrometer stage Edmund Optics 37-983
Dovetail optical rail 3" ThorLabs RLA075/M
Dovetail rail carrier 1" ThorLabs RC1
Avalanche photodiode Helix 902 Digi-Key HELIX-902-200
Objective holder XY Translator  ThorLabs ST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6" ThorLabs MB6
Nexus otpical table 4' x 6' ThorLabs T46HK
Stainless steel cap screws ThorLabs HW-KIT5/M
Acrylic  sheet Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit Dow Corning Sylgard 184
Epoxy gel  Walmart/Home Depot 2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle B-D 305167
23G Precision glide needle B-D 305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm ThorLabs BA1/M
Wire shelve posts 36" Alera AALESW59PO36SR
Wire shelves Alera ALESW582424SR
Post and angle clamp ThorLabs SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber Wheaton W851020
Rubber stopper Home Science Tools CE-STOP01C

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 121 अक्षत दिल प्रतिदीप्ति स्पंदित स्थानीय क्षेत्र कैल्शियम संभावित कार्रवाई Rhod-2 डि-8-ANEPPS
स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: बरकरार दिल में सेलुलर संकेतों इमेजिंग
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Aguilar-Sanchez, Y., Fainstein, D., Mejia-Alvarez, R., Escobar, A. L. Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts. J. Vis. Exp. (121), e55202, doi:10.3791/55202 (2017).

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