Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen
Summary
Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.
Abstract
Im Herzen sind molekulare Signalstudien in der Regel in isolierten Myozyten durchgeführt. Jedoch können viele pathologische Situationen wie Ischämie und Arrhythmien nur vollständig an der gesamten Organebene verstanden werden. Hier stellen wir die spektroskopische Technik der lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM), die die Messung von zellulärer Signale im intakten Herzen ermöglicht. Die Technik basiert auf einer Kombination aus einer Langendorff perfundierten Herzen und Lichtleitfasern Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen. LFFM hat verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf Physiologie des Herzens unter normalen und pathologischen Bedingungen zu studieren. Mehrere können Herz-Variablen mit unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren überwacht werden. Dazu gehören cytosolischen [Ca 2+], intra-Retikulum [Ca 2+] und Membranpotentialen. Die exogenen Fluoreszenzsonden werden angeregt und die emittierte Fluoreszenz mit drei verschiedenen Anordnungen von LFFM Epifluoreszenz-Technik nachgewiesens in diesem Papier. Die zentralen Unterschiede zwischen diesen Techniken sind die Art der Lichtquelle für die Anregung verwendet, und auf dem Weg das Anregungslicht moduliert wird. Der gepulste LFFM (PLFFM) verwendet Laserlichtimpulse, während eine kontinuierliche Welle LFFM (CLFFM) kontinuierliches Laserlicht zur Anregung verwendet. Schließlich Leuchtdioden (LEDs) als eine dritte Lichtquelle verwendet. Diese nicht-kohärente Anordnung gepulst LED-Fluoreszenzmikroskopie (PLEDFM) genannt.
Introduction
Das Herz ist das zentrale Organ des kardiovaskulären Systems. Die Kontraktion des Herzens wird durch eine Erhöhung der intrazellulären initiiert [Ca 2+]. Die Beziehung zwischen der elektrischen Erregbarkeit und Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Freisetzung wurde 1 in enzymatisch dissoziierten Zellen historisch untersucht, 2. Jedoch sind Herzzellen elektrisch, metabolisch und mechanisch gekoppelt 3, 4. Wenn isoliert, sind die Myozyten nicht nur physisch entkoppelt, sondern Myozyten aus verschiedenen Schichten werden während der Dissoziation 5 gemischt. Darüber hinaus , trotz der enormen Vorteile , die aus der Untersuchung von isolierten Zellen unter voltage clamp Bedingungen entstanden sind, 6, 7, 8 die intrinsische Natur des Herzens als elektrischer Syncytium always stellt sich die Frage, wie funktionell verschieden von denen , die in dem Gewebe 3 dissoziierten Zellen.
In diesem Manuskript beschreiben wir die in der Erkenntnis der Herzphysiologie erhalten Fortschritte durch die Verwendung von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie (LFFM) Techniken im intakten Herzens. LFFM nutzt fluoreszierende Indikatoren mehrere physiologische Variablen wie zytosolischen Ca 2+, intra Retikulum (SR) Ca 2+ und Membranpotential zu messen. Diese Messungen können gleichzeitig und in Verbindung mit ventrikulären Druck 9, 10, Elektrokardiogramme 9, elektrische Aktionspotentiale (APs), Ionenstrom – Aufnahmen und Blitzphotolyse von caged Verbindungen 4, 11 erhalten. Darüber hinaus können diese Messungen in der Nähe von Stimulation des intakten Herzens bei höheren Frequenzen erhalten werdenr physiologischen Raten. Obwohl mehrere Artikel 9, 11, 12, 13, haben 14 von unserer Gruppe veröffentlicht LFFM Techniken, die Vermutung der technischen Komplexität mit dieser Technik verbunden hat ihren massiven Einsatz bei der Untersuchung ex vivo physiologischen Erscheinungen in das Herz und andere Organe verhindert.
Die LFFM Technik (Figur 1) basiert auf Epifluoreszenz – Messungen unter Verwendung eines Mehrmoden – Lichtwellenleiter in Kontakt mit dem Gewebe erhalten wird . Wie bei jedem Kontakt Fluoreszenz-Imaging-Technik hängt die optische Auflösung von dem Durchmesser und der numerischen Apertur (NA) der Faser. Eine höhere NA und kleinere Durchmesser der Faser wird die räumliche Auflösung der Messungen zu erhöhen. NAs und Faserdurchmessern von 0,22 bis 0,66 und von 50 um bis 1 mm bzw. liegen. Imdie NA Rillen wird das Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) durch die Annahme Photonen verbessern aus einem größeren Raumwinkel ankommt. Um als Epifluoreszenz Vorrichtung zu wirken, wird der Lichtstrahl fokussiert in die optische Faser mit einer asphärischen Linse oder einer Epifluoreszenz Ziel wo die NA der Linse und der Faser übereinstimmen. Diese Anpassung maximiert die Energieübertragung zur Anregung und zum Sammeln der Photonen, die von dem Fluorophor emittiert zurück.
Um die exogenen Fluoreszenzindikatoren im Gewebe, verschiedene Lichtquellen und Beleuchtungsarten geladen zu erregen können genutzt werden. Unsere wegweisenden Arbeiten des gepulsten lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie 3, 12 (PLFFM) eingesetzt , um eine Low-Cost – Pikosekunden – Laser (Abbildung 1a, PLFFM) verwendet wird . Diese Art der Lichtquelle hat den großen Vorteil, spannenden einem großen Anteil an Fluorophormoleküle unter dem Bereich Beleuchtung ohne den Farbstoff im wesentlichen Bleichen durchder kurzen Impulsdauern 12. Zusätzlich erlaubt die Verwendung von ultrakurzen Pulsen , die Beurteilung der Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffes 12. Die Fluoreszenzlebensdauer ist eine Eigenschaft , die verwendet werden kann , den Anteil von Farbstoffmolekülen an Ca 2+ gebunden zu quantifizieren. Leider ist das zeitliche Zittern der Impulse und Variationen in der Amplitude von Impuls zu Impuls begrenzen die Anwendung dieser experimentellen Strategie zu Fällen, in denen die Veränderung der Fluoreszenz durch den Liganden produziert an den Farbstoff-Bindungs groß.
Continuous Wave (CW) Laser sind in der Regel als Hauptbeleuchtungsquelle in LFFM (1b, CLFFM) verwendet. Der Laserstrahl kann kontinuierlich das Gewebe beleuchten, oder ferroelektrisch moduliert werden kann. Die ferroelektrische Modulation des Strahls ermöglicht, die Erzeugung von Mikrolichtimpulse. Diese Modulation kann durch externe Hardware gesteuert werden. Dieser Vorgang ist nicht nur dramatisch reduziert ter zeitliche jittering von Lichtpulsen sondern ermöglicht auch Strahlen unterschiedlicher Wellenlängen zu mischen. Das Mischen von Strahlen wird durch Multiplexen von Strahlen von verschiedenen Lasern durchgeführt. Als Folge können mehrere Farbstoffe unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen angeregt werden Messungen einer Vielzahl von physiologischen Variablen durchzuführen, beispielsweise Rhod-2 für cytosolische Ca 2+, MagFluo4 für intra-SR Ca 2+ und Di-8-ANEPPS für Membranpotential.
Obwohl Laser vorhanden verschiedene Vorteile, wie die Lichtquelle in LFFM, andere Arten von Lichtquellen, einschließlich Leuchtdioden (LEDs) verwendet werden. In diesem Fall bestand die Anregungslichtquelle eines InGaN – LED (1c, PLEDFM). In LEDs werden Photonen spontan emittierten wenn Elektronen aus dem Leitungsband mit Löchern in dem Valenzband rekombinieren. Der Unterschied mit Festkörperlaser ist, dass die Emission nicht von anderen Photonen angeregt wird. Dies resultiert in einer nicht-kohärenten Strahl undeine breitere spektrale Emission für LEDs.
Verschiedene Arten von High-Power-LEDs verwendet werden. Für AP – Aufnahmen Di-8-ANEPPS verwenden und für Ca 2+ Transienten aufgezeichnet unter Verwendung von Fluo-4 oder Mag-fluo-4, wir eine LED verwendet , die eine typische Peakemission bei 485 nm (blau) und einer Halbwertsbreite von 20 nm hat (Abbildung 1d). Für Ca 2+ Transienten mit Rhod-2 aufgezeichnet hatte die LED eine typische Spitzenemission bei 540 nm (grün) und eine Halbwertsbreite von 35 nm (Figur 1d). LEDs emittieren in einer Band Wellenlänge und daher Filter benötigen, um ihre spektrale Emission zu verringern. Zusätzlich kann gepulst Licht mit einer Rate von 1,6 kHz mit einer Dauer von 20 us erzeugt. Die LEDs wurden mit einem schnellen Leistungs-MOSFET-Feldeffekttransistor gepulst. Die gleichzeitige Aufnahmen mit verschiedenen Indikatoren können die LEDs von Zeitmultiplex durchgeführt werden. Leider von LEDs emittiert wird, Licht ist schwieriger auf eine Faseroptik zu fokussieren im Vergleich zu einem Laserstrahl. Somit wird der Hauptnachteil usLEDs ing ist, dass ihre Emissionsprofile Winkelverschiebungen haben (± 15 °) von der Hauptachse, und eine Hilfsoptik muss verwendet werden, um es zu korrigieren.
In allen optischen Konfigurationen zuvor beschrieben, wird das Anregungslicht mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels reflektiert wird. Der Strahl wird anschließend von einer asphärischen Linse und ein Mikroskopobjektiv auf ein Multimode-Glasfaser fokussiert, die auf dem Gewebe positioniert ist. Wie in jeder Epifluoreszenz Anordnung dient der dichroitische Spiegel auch die Anregung von dem emittierten Licht zu trennen. Das emittierte Lichtspektrum reist zurück durch einen Sperrfilter jede reflektierte Anregung zu entfernen. Schließlich wird das emittierte Licht mit einem Objektiv auf einen Photodetektor (1) fokussiert.
Die Transduktion von Licht in elektrischen Strom wird durch Silizium-Avalanche-Photodioden ausgeführt. Diese Dioden haben eine schnelle Reaktion und eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht niedrige Lichtdetektion. DasPhotostrom durch die Avalanche – Photodioden erzeugt wird, kann auf zwei Arten amplifiziert werden: a Transimpedanzverstärker einen resistiven Rückkopplungselement (1e) oder durch einen Integrator aufweist , um den Strom in eine Spannung (1f) zu konvertieren. Unter Verwendung des ersten Ansatzes ist die Ausgangsspannung proportional zum Photostrom und den Rückkopplungswiderstand. Ein typisches Beispiel für die resistive Erfassung von Pikosekunden – Laserimpulse in den Figuren 2a, 2b und 2c gezeigt. Panel 2a veranschaulicht den Ausgang des Transimpedanzverstärkers und Platte 2b eine Zeitexpansion des Intervalls mit einem Stern (*) gekennzeichnet . Ein Spitzenverfolgungsalgorithmus wurde implementiert , um die Spitze (rot) und der Basis (grün) für den Fluoreszenzantworten 12 zu ermitteln. Die Messung der Fluoreszenzbasis liefert Informationen sowohl der Dunkelstrom der Lawinenphotodiode und die von Umgebungs lig eingeführt Interferenzenht und elektromagnetische Kopplung. Eine Darstellung von Peaks und Basen ist in Abbildung 2c dargestellt ist . Diese Figur veranschaulicht die Fluoreszenz von dem Farbstoff emittiert (Rhod-2) , gebunden an Ca 2+ während des Herzzyklus eines schlagenden Herzens parakeet.
In dem zweiten Verfahren wird die Ausgangsspannung des Integrators eine Funktion des Stroms und kapazitiver Rückkopplung (Figuren 2d, 2e und 2f). Abbildung 2f zeigt zwei aufeinanderfolgende Integrationszyklen: die erste ohne externe Beleuchtung und die zweite mit der angelegten Lichtimpulse von einem gepulsten LED. Eine detaillierte Beschreibung ist in den Figuren 2g und 2h dargestellt. Dieser Ansatz, wenn auch aufwendiger, bietet eine größere S / N aufgrund der Abwesenheit von thermischem Rauschen im Rückkopplungskondensator. Das Instrument umfasst eine Zeitstufe, die alle Steuer- und Multiplexen des Anregungslichts erzeugt und Befehle, um die Integration und heads reset Perioden. Dies wird üblicherweise mit einer digitalen Signalverarbeitungsschaltung durchgeführt , die auch eine digitale Differentiation des integrierten Ausgangssignals ausführt durch Berechnen eines on-line – Regression der Daten. Im Falle einer Widerstandsrückkopplung unter Verwendung jeder A / D-Erfassungskarte verwendet werden.
Schließlich ist unsere LFFM Technik sehr vielseitig und kann angepasst werden, von mehr als einer Region aufzuzeichnen. Hinzufügen ermöglicht einen Strahlteiler in dem Lichtweg uns das Licht in zwei optische Fasern zu splitten. Jede optische Faser kann dann auf verschiedene Bereiche eines Gewebes angeordnet werden, um unabhängig zu erregen und Aufzeichnungsemission von den exogenen Fluoreszenzsonden. Diese Änderung ermöglicht es uns, wie anatomische regionale Unterschiede physiologischen Variablen beeinflussen zu beurteilen. Wobei eingesetzte 3 zeigt einen Strahlteiler aufgeteilt wit das CW Anregungslicht , so dass zwei optische Fasern verwendet werden , um zu messen transmurale elektrische oder intrazellulärem [Ca 2+] Ebenenh-Moll-Invasivität. Transmuraler Signale kann durch Platzieren einer Faser auf dem Endokard und der andere auf dem Epikard Schicht der Ventrikelwand aufgezeichnet werden. Daher hat die LFFM Technik die Fähigkeit, den zeitlichen Verlauf der zellulären Signale in unterschiedlichen Bereichen zu messen, und kann verwendet werden, um zu testen, ob regionale Veränderungen unter pathologischen Situationen auftreten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier wird bei der Beschreibung der lokalen Feldfluoreszenztechniken zentriert die Funktion von Herzmuskelzellen zu bewerten ex vivo. Die Untersuchung dieser Zellen in einer gekoppelten Umgebung ist nicht nur physiologisch, sondern ist auch sehr geeignet für die Beurteilung der Organebene Pathologien. Die zelluläre Ereignisse elektromechanischen Kopplung (ECC) zugrunde liegen kann mit dem Einsatz von molekularen Sonden auf der ganzen Organebene ausgewertet werden , die 2+ Dynamik intrazellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Alicia Mattiazzi für kritische Diskussion der vorliegenden Arbeit. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NIH (R01 HL-084487) zu ALE unterstützt.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
References
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