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Methodenartikel

Akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch: Eine Methode zur Beurteilung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Neurogenese und die Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen

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DOI:

10.3791/55203

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26. Juni 2017

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In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt Methoden, um akute und chronische Hyperglykämie Modelle in Zebrafisch zu etablieren. Ziel ist es, die Auswirkungen von Hyperglykämie auf physiologische Prozesse, wie zB konstitutive und verletzungsinduzierte Neurogenese, zu untersuchen. Die Arbeit hebt auch die Verwendung von Zebrafisch hervor, um radiomarkierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT zu folgen.

Zusammenfassung

Hyperglykämie ist ein wichtiges gesundheitliches Problem, das zu Herz-Kreislauf-und zerebralen Dysfunktion führt. Zum Beispiel ist es mit erhöhten neurologischen Problemen nach Schlaganfall assoziiert und zeigt, dass neurogene Prozesse beeinträchtigt werden. Interessanterweise hat sich der adulte Zebrafisch vor kurzem als ein relevantes und nützliches Modell entwickelt, um Hyperglykämie / Diabetes nachzuahmen und die konstitutive und regenerative Neurogenese zu untersuchen. Diese Arbeit stellt Methoden zur Verfügung, um Zebrafisch-Modelle der Hyperglykämie zu entwickeln, um die Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Gehirnzellproliferation unter homöostatischen und Hirnreparaturbedingungen zu untersuchen. Eine akute Hyperglykämie wird unter Verwendung der intraperitonealen Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) in erwachsenen Zebrafisch etabliert. Chronische Hyperglykämie wird durch Eintauchen von adultem Zebrafisch in D-Glucose (111 mM), das Wasser für 14 Tage enthält, induziert. Blut-Glukose-Messungen sind für diese verschiedenen Ansätze beschrieben. Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf konstitutiv aNd regenerative Neurogenese, durch die Beschreibung der mechanischen Verletzung des Telencephalon, Sezierung des Gehirns, Paraffin Einbettung und Schnitt mit einem Mikrotom, und die Durchführung von Immunhistochemie Verfahren, werden nachgewiesen. Schließlich wird auch die Methode zur Verwendung von Zebrafisch als relevantem Modell zur Untersuchung der Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen (hier [ 18 F] -FDG) unter Verwendung von PET / CT beschrieben.

Einleitung

Hyperglykämie ist definiert als übermäßige Blutzuckerwerte. Obwohl es eine Situation von akutem Stress widerspiegeln könnte, ist Hyperglykämie auch eine Bedingung, die oft zu einer Diagnose von Diabetes, einer chronischen Erkrankung der Insulinsekretion und / oder Resistenz führt. Im Jahr 2016 hat die Zahl der Erwachsenen, die mit Diabetes leben, 422 Millionen weltweit erreicht, und jedes Jahr sterben 1,5 Millionen Menschen an dieser Krankheit und sind damit ein wichtiges Gesundheitsproblem 1 . In der Tat führt unkontrollierter Diabetes zu mehreren physiologischen Störungen, die das Herz-Kreislauf-System, die Nieren und die peripheren und zent....

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Protokoll

Erwachsene Wildtyp Zebrafisch ( Danio rerio ) wurden unter Standard-Photoperiode (14/10 h hell / dunkel) und Temperatur (28 ° C) Bedingungen gehalten. Alle Versuche wurden im Einklang mit den französischen und europäischen Gemeinschaftsrichtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung (86/609 / EWG und 2010/63 / EU) durchgeführt und wurden vom örtlichen Ethikausschuss für Tierversuche genehmigt.

1. Etablierung eines Modells der akuten Hyperglykämie in Zebrafisch

  1. Eine Stammlösung aus Trikose (MS-222) durch Auflösen von 400 mg Tricainpulver in 97,9 ml Wasser und 2,1 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 9) vorbereiten. D....

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Ergebnisse

Unter Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurde die intraperitoneale Injektion von D-Glucose (2,5 g / kg Körpergewicht) auf adultem Zebrafisch durchgeführt und führte zu einer signifikanten Erhöhung der Blutzuckerwerte von 1,5 h nach der Injektion ( 1A ). 24 h nach der Injektion waren die Blutzuckerwerte zwischen D-Glucose und PBS-injizierten Fischen ähnlich. Für die chronische Behandlung wurde Zebrafisch in D-Glucose-Wasser (111 mM) ein.......

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Diskussion

Diese Arbeit beschreibt verschiedene Methoden, um akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch zu etablieren. Die Hauptvorteile dieser Verfahren sind: (1) sie erlauben eine Verringerung der Anzahl der Säugetiere, die für die Forschung verwendet werden, (2) sie sind einfach einzurichten und schnell zu implementieren, und (3) sie sind wirtschaftlich. Daher erlauben solche Modelle die Untersuchung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf eine große Anzahl von Tieren, um ihre Auswirkungen auf verschiedene phys.......

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Offenlegungen

Es wurden keine potenziellen Interessenkonflikte offengelegt.

Danksagungen

Wir danken den Direction des Usages du Numérique (DUN) von der Universität La Réunion für die Bearbeitung des Videos (insbesondere Jean-François Février, Eric Esnault und Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan für die Voiceover, Mary Osborne-Pellegrin zum Korrekturlesen Die Voice-over und die CYROI-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der La Réunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Europäische Union (CPER / FEDER) und Philancia Association. ACD ist ein Empfänger eines Stipendiums Zuschuss aus der Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche,....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Luer-Lok SpritzeBD, USA309628
4',6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)Sigma-Aldrich, DeutschlandD8417
7 mL Bijou Behälter Plain LabDutscher, Frankreich080171
D-GlukoseSigma-Aldrich, Deutschland67021
DigitalkameraLife Sciences, JapanHamamatsu ORCA-ER
Einweg-Basisformen Simport, KanadaM475-2
Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488Life Technologies, USAA21206
EinbettungszentrumThermo Scientific, USAShandon Histocentre 3
FluoreszenzmikroskopNikon, JapanEclipse 80i
Fluordesoxyglucose (18F-FDG)Zyklotron, Frankreich
Blutzuckermessgerät TeststreifenLifeScan, FrankreichOne-Touch 143 Ultra
Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 594Life Technologies, USAA11005
In-Vivo Imaging SystemTriFoil Imaging, KanadaTriumph Trimodalität 
MikrotomThermo Scientific, USAMicrom HM 355 S
Monoklonale Maus Anti-PCNADAKO, USAKlon PC10
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich, DeutschlandP6148-500G
Polyklonales Kaninchen Anti-GFAPDAKO, USA
Objektträger-TrockenbankElektrothermisch, USAMH6616
NatriumchloridSigma-Aldrich, DeutschlandS9888
Natriumcitrat Trinatriumsalz dehydrieren Prolabo, Frankreich27833.294
Sterile NadelBD Microlance 330 G 1/2 ; 0,3 mm & fach 13 mm
Student Dumont #5 PinzetteFine Science Tools91150-20
Chirurgische Schere für StudentenFine Science Tools91400-14
Superfros Plus GoldSlides Thermo Scientific, USAFT4981GLPLUS
OperationsmikroskopLeica, FrankreichM320-F12
GewebeeinbettungskassettenSimport, KanadaM490-10
GewebeeinbettungsmediumLeicaBiosystems, USA39602004
ToluolSigma-Aldrich, Deutschland244511
Tricain MS-222Sigma-Aldrich, DeutschlandA5040
Triton X100Sigma-Aldrich, DeutschlandX100-500 mL
Vectashield Medium Vector Laboratories, USAH-1000
XylolSigma-Aldrich, Deutschland534056
FischstammAB
stark>Salzphosphatpuffer (10X PBS) pH 7,4 (für 1 Liter)Zur Zubereitung von 10X PBS die folgenden Salze hinzufügen und mit destilliertem Wasser
auf 1 Liter vervollständigenKaliumchlorid (MM : 74,55 g/mol): 2,00 gSigma-Aldrich, Deutschland746436<
>Kaliumphosphat monobasisch (MM: 136,09 g/mol): 2,40 gSigma-Aldrich, Deutschland795488
Natriumchlorid (MM : 58,44 g/mol): 80,00 g  Sigma-Aldrich, DeutschlandS9888
Natriumphosphat zweibasisch (MM: 141,96 g): 14,40 gSigma-Aldrich, Deutschland795410
Z033429 <

Referenzen

  1. W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
  2. Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
  3. Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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