Summary

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Published: February 06, 2017
doi:

Summary

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Abstract

noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite esporádica em todo o mundo. Porque a maioria das infecções são ou transmitida diretamente por via da pessoa-a-pessoa ou indirectamente através de superfícies ambientais ou alimentos, fômites contaminados e superfícies inanimadas são veículos importantes para a propagação do vírus durante surtos de norovírus.

Nós desenvolvido e avaliado um protocolo com cotonetes macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus humanos de superfícies duras. Comparado com cotonetes com ponta de fibra ou toalhetes anti-estáticos, compressas macro-espuma permitir a recuperação de vírus (intervalo 1,2-33,6%) das superfícies de assento de sanita de até 700 cm2. O protocolo inclui passos para a extracção do vírus a partir dos cotonetes e ao aumento da concentração do RNA viral utilizando colunas de centrifugação. No total, 127 (58,5%) das 217 amostras de esfregaço que tinham sido recolhidas a partir de superfícies em navios de cruzeiro e instalações de cuidados de longo prazo, onde norovirus gastroenterite tinham sidorelatado testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. Destes 29 (22,8%) poderia ser genotipados com sucesso. Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando o protocolo desenvolvido que pode ajudar a determinar o nível de contaminação do meio ambiente durante surtos, bem como a detecção de vírus quando as amostras não estão disponíveis clínicos; pode também facilitar o acompanhamento da eficácia de estratégias de remediação.

Introduction

Noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo 1, 2, 3. O vírus é extremamente contagiosa ea transmissão ocorre por meio de pessoa direta a interacção pessoa ou indirectamente, através de contacto com os alimentos contaminados, água ou superfícies ambientais. Norovírus pode ser derramado por longos períodos e prolongada sobrevivência do vírus em superfícies ambientais tem sido documentada 1, 2, 3. Durante derramamento de pico, bilhões de partículas de vírus são liberados por grama de fezes e vômito também contém um número suficiente de partículas virais para causar a infecção 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Além disso, a transferência do vírus entre as superfícies inanimadas e pele humana pode ocorrer facilmente 2, 11, 12. Por isso, o monitoramento de contaminação ambiental pode ajudar na investigação de surtos e na avaliação da eficácia da limpeza e procedimentos de desinfecção.

Vários protocolos de amostragem ambientais foram descritos para a detecção de rotavírus, colifago MS2, calicivírus felino (FCV), e bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. No entanto, as condições de validação descritos nestes estudos, incluindo a dessecação rápida (<1 hora) e da superfície reduzida (25 x 100 cm 2), pode não representar adequadamente as configurações de campo. Além disso, a baixos níveis de contaminação de Enviro esperadosuperfícies nmental requerem protocolos que são capazes de detectar muito poucas partículas de vírus.

Foi desenvolvido um método de amostragem de superfície à base de macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus. Este método foi validado durante vários surtos de norovírus. O protocolo inclui 1) como coletar amostras de esfregaço de superfícies ambientais (2) a melhor forma de manter a integridade das amostras durante a recolha e envio para o laboratório, e 3) testes de laboratório e tipagem de norovirus.

Protocol

1. Swab Amostragem no campo Usar um par limpo de luvas. Medir o tamanho da área de amostragem, sem tocar na superfície utilizando uma fita de medição ou régua. Tente estimar a área com a maior precisão possível e preencher um formulário de relatório (Tabela Suplementar 1). Verifique o kit cotonete para possíveis fugas e amostras rótulo sacos de transporte e kits de esfregaço. Mover a haste de toda a área de amostragem, como segue: u…

Representative Results

A Figura 1 apresenta um fluxograma do protocolo de amostragem cotonete. Este protocolo consiste em quatro etapas principais; 1) coleta de amostra, 2) o armazenamento de amostras e transporte, 3) purificação viral RNA e concentração e 4) ensaio de RT-qPCR e genotipagem. Figura 1: Fluxograma do protocolo final para amostragem de …

Discussion

Os norovírus têm uma dose infecciosa humana 50% entre 18 e 10 3 partículas de vírus 20. Portanto, mesmo a contaminação de baixo nível de superfícies podem representar um risco para a saúde pública. Vários aspectos do protocolo de amostragem swab foram avaliados, incluindo: 1) diferentes materiais de esfregaço, 2) cotonetes condição de armazenamento durante o transporte, 3) concentração de RNA viral, e 4) colifago MS2 como controle de extração interno.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Generic name for kits
Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
 RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
RNA run-off transcripts Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891). 
Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500 GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI). 
Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

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Cite This Article
Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

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