Utvikling av en økonomisk DNA leveringssystem "Acufection" og dens anvendelse i Skin Research
Summary
Denne protokollen er et kostnadseffektivt alternativ for uttrykking av nakent DNA-plasmid i musehud. Det overordnede målet for protokollen er å levere immun-relaterte gener i hudvev for å avgrense den funksjonelle rolle av et spesifikt gen i kutan inflammasjon.
Abstract
Feilregulering av immunrespons i hud er forbundet med mange humane hudlidelser. Direkte overføring av immunrelaterte gener i hudvev er en spennende måte å undersøke immunmodulering av kutan inflammasjon i musemodeller av humane sykdommer. Her presenterer vi en kostnadseffektiv protokollen som leveres nakent DNA i musehud og fører til transgen ekspresjon. Fremgangsmåten er laget "acufection", betegner acu punktering-mediert DNA-trans sjon. For å utføre acufection, ble musehud først tilført DNA i fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter stukket lett med en bunt av akupunkturnåler for å lette opptaket av DNA og transfeksjon inn i cellene. Plasmid-DNA blir antagelig tas opp av keratinocytt og dendrittiske celler (DCS) i huden og uttrykte til protein. Mekanisk stikk med nåler per se ikke forårsake hudskader eller indusere keratinocyte aktivering. Uttrykketav de transfekterte gener ble påvist i huden på begge transkripsjonelle og translasjonelle nivåer etter acufection i 2 dager og opprettholdes opp til 7 dager. Det primære målet for utviklingen av denne acufection metoden var å undersøke en tidligere udefinert isoform av IL-15. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, en alternativt spleiset IL-15-isoform med delvis fjernet exon 7 (IL-15ΔE7) ble uttrykt i huden og deretter behandlet med en Toll-lignende reseptor 7 (TLR7) agonist, Imiquimod (IMQ), for å indusere inflammasjon. Acufection levert IL-15ΔE7 i hud trykkes keratinocyttproliferering, epidermal tykkelse og neutrofilrekruttering i IMQ-indusert kutan inflammasjon. Med økende interesse for å identifisere de regulatoriske mekanismer av kutan inflammasjon, protokollen som er beskrevet her gir en kostnadseffektiv og allsidig alternativ til genet våpensystem eller microseeding for DNA-transporten in vivo. Det kan eventuelt gjøre det mulig oppdagelse av funksjonen til en romangen i huden eller for å undersøke ny behandling av kutane sykdommer.
Introduction
Huden er den første linjen i host forsvar. Keratinocytter (KCs) er den hovedcelletype som i hud hos mennesker og mus. I respons på miljømessige stimuli (for eksempel sollys, oksygen, kjemikalier og patogene invasjon), blir KCs aktivert og fremstille et bredt spekter av pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, slik som IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α og GM-CSF-1. Sammen utløse rekruttering av immunceller i huden. Forverret kutan inflammasjon er ofte forbundet med en rekke humane sykdommer, inkludert akutt ektopisk kontakteksem og kroniske T-celle-mediert inflammasjon (for eksempel allergisk kontakt dermatitt og psoriasis) 2. Modulering av proinflammatoriske responser i huden ved å hemme aktiveringen KC er en plausibel tilnærming til behandling av kutan inflammasjon. Denne protokollen beskriver en ny tilnærming til forbigående å uttrykke et cytokin gen i epidermis for å studere immun response en følge av en slik behandling i huden.
Epidermis komponerer mest overfladiske lag av huden. Den tjener som en fysisk barriere for å holde eksterne stoffer slik som nukleinsyrer og patogener fra å komme inn i de dypere lag av huden. Flere nålefri teknikker har blitt etablert for epidermal DNA-overføring 3, 4. DNA i løsning eller i forbindelse med kationiske liposomer eller adenovirusvektorer har vært direkte anvendt på overhuden som er modifisert med teknikker, så som fjernelse av stratum corneum eller ved behandling med depilating reagens. Fjerning av forhornet epitelet letter DNA krysset epidermisbarrierefunksjonen og interaksjon med keratinocyter og Langerhans-celler for å indusere immunresponser 5. Mens en stor overflate er tilgjengelig for DNA overføring og denne tilnærmingen ikke involverer nåler, det er ulemper herunder kravetfor de store mengder av DNA (minst 10 – 100 ug), harde behandlingen på huden ved stripping, og de ujevne resultater i indusering av immunrespons i de immuniserte dyrene uten DNA-transporten booster 6. Mikropartikkel-mediert intracellulær levering av nakent DNA til huden har vist seg å være svært effektiv og reproduserbar for å indusere immunrespons 7, 8. En håndholdt genpistol har blitt brukt for å bombardere huden målstedet med plasmid DNA-belagte gull partikler 2 mikrometer diameter i størrelse ved hjelp av helium under trykk luftstrøm ni. Plasmid-DNA blir antagelig tas opp av KCsand dendrittiske celler (DCS) i huden og proteinet blir uttrykt lokalt eller som transporteres til drenerende lymfeknuter ved DC 10. Selv om genpistol systemet er enkelt og krever en begrenset teknisk erfaring, er kostnaden for fremstilling og levering av "DNA bulla "(dvs. gull pulvere, heliumgass) og for den genpistol selv har begrenset dens generelle anvendelse. I tillegg er det behov for en heliumgassleveringssystem begrenser den enkle genpistol transport når forsøkene utføres på forskjellige steder. Microseeding har vist seg å oppnå en høyere effektivitet av genoverføring enn enkel injeksjon og partikkelbombardement 11. Microseeding benytter en tatovering pistol for å levere DNA til huden uten bruk av partikkel kuler 11. oscillering av mikronåler på huden ved hjelp av denne metode vil sannsynligvis direkte skrape cellemembranen og derved overføre DNA til flere celler samtidig. imidlertid, smerte forbundet med det store antall injeksjoner med 0,254 mm diameter nåler er en ulempe.
Her gir vi en alternativ tilnærming til DNA levering in vivo. Den "acufection" </strong> protokoll vi beskrevet her tilveiebringer en økonomisk og effektiv måte for å levere plasmid-DNA i musehud. I korthet ble ti akupunktur nåler (0,2 mm i diameter x 13 mm lengde) som var bundet i en bunt av klebebånd. Et volum på 10 pl PBS med 10 pg av plasmid DNA inneholdende transgenet av interesse ble plassert på den barberte, riktige krem-behandlede flanke hud. Ved hjelp av akupunktur nål bunten for å oscillere overflaten (1 cm x 1 cm) av huden, ble keratin på hornlaget løsnes og plasmid DNA påført på overflaten ble absorbert inn i epidermis. Hudskader ble overvåket og funnet å være minimal. Ekspresjon av det transfekterte gen i den acufected huden ble bekreftet ved både kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) og ELISA. Den immunmodulerende virkninger av acufection-levert IL-15ΔE7 på kutan inflammasjon ble demonstrert ved bruk av IMQ-behandlede mus modell 12. Mens acufection viser seg å være en enkel og mindre demanding metode for DNA-transporten in vivo, den optimale mengden av DNA for forskjellige gener og tider for å stikke brukerens hud må være nøye optimalisert for å oppnå reproduserbare resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiske trinn for å sikre ekspresjonen av acufected plasmid-DNA er for jevnt å oscillere og løsne hornlaget av huden. Mens du skyver nålene forsiktig uten å kutte i huden, bør kraften være vanskelig nok å trykke på overflaten. For å lette opptaket av DNA i 10 ul løsning på en 1 cm x 1 cm overflateareal, bør nålene oscillere opp-og-ned til omtrent 100 ganger i 30 sek. Man kan bestemme den kraft som må stikke huden, og ved å notere det antall ganger som er nødvendig for å gi den beste ekspresjo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av bevilgning fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Vi takker legene. Betty Wu-Hsieh og Chien-Kuo Lee på NTU, Leigh Zerboni ved Stanford University og Dr. Peter Hoffmann ved University of Hawaii for å lese manuskriptet, Yun Chien ved NTU for teknisk assistanse, og Dr. Wen-Chi Wei ved Landbruk Bioteknologi Research Center ved Academia Sinica for teknisk rådgivning.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
