Utveckling av en ekonomisk DNA Delivery System av "Acufection" och dess tillämpning på Skin Research
Summary
Detta protokoll är ett kostnadseffektivt alternativ för att uttrycka naket plasmid-DNA i mushud. Det övergripande målet med protokollet är att leverera immunrelaterade gener i hudvävnad för att avgränsa den funktionella rollen för en specifik gen i kutan inflammation.
Abstract
Dysreglering av immunsvar i huden är förknippad med många mänskliga hudsjukdomar. Direkt överföring av immunrelaterade gener i hudvävnad är en fascinerande metod för att undersöka immunmodulering av kutan inflammation vid musmodeller av mänskliga sjukdomar. Här presenterar vi en kostnadseffektiv protokoll som levereras naket DNA i mus huden och leder till transgen uttryck. Metoden är myntade "acufection", som betecknar acu punkteringsmedierad DNA-trans-fection. Att utföra acufection ades mushud först infunderas med DNA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan prickas lätt med en bunt av akupunkturnålar för att underlätta absorptionen av DNA och transfektion in i celler. Plasmid-DNA antagligen tas upp av keratinocyter och dendritiska celler (DC) i huden och uttrycks in i protein. Mekanisk prick med nålar i sig inte orsaka hudskador eller framkalla keratinocytdifferentieringen aktivering. Uttrycketav de transfekterade generna detekterades i huden vid både transkriptionella och translationella nivåer efter acufection under 2 dagar och underhållas upp till 7 dagar. Det primära målet för utvecklingen av denna acufection metod var att undersöka en tidigare odefinierad isoform av IL-15. Användning av denna metod, en alternativt splitsad IL-15-isoformen med delvis borttagen exon 7 (IL-15ΔE7) uttrycktes i huden och behandlas därefter med en Toll-liknande receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), för att inducera inflammation. Acufection levererade IL-15ΔE7 i huden tryckte keratinocytproliferation, epidermal tjocklek och neutrofil rekrytering i IMQ-inducerad kutan inflammation. Med ökande intresse i att identifiera de regulatoriska mekanismerna för kutan inflammation, beskrivna protokollet här ger en kostnadseffektiv och mångsidig alternativ till genkanonen systemet eller microseeding för DNA-leverans in vivo. Det kan eventuellt tillåta upptäckten av funktionen av en nygenen i huden eller för att utreda ny behandling för kutana sjukdomar.
Introduction
Huden är den första raden av värdförsvar. Keratinocyter (KCS) är den huvudsakliga celltypen i huden hos människor och möss. Som svar på miljöstimuli (t.ex. solljus, syre, kemikalier och patogena invasion), är KCS aktiveras och producerar ett brett spektrum av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner såsom IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-a α och GM-CSF en. Tillsammans utlösa rekrytering av immunceller till huden. Förvärras kutan inflammation är ofta förknippat med många humana sjukdomar innefattande akut ektopisk kontaktdermatit och kroniska T-cellmedierad inflammation (t.ex. allergisk kontaktdermatit och psoriasis) 2. Modulera proinflammatoriska svar i huden genom att hämma KC-aktivering är ett rimligt tillvägagångssätt för att behandla kutan inflammation. Detta protokoll beskriver en ny metod för övergående uttrycka en cytokin gen i överhuden för att studera immun resPonse en följd av en sådan behandling i huden.
Epidermis komponerar det mest ytliga lagret av huden. Det fungerar som en fysisk barriär hålla externa substanser såsom nukleinsyror och patogener från att komma in de djupare hudlagren. Flera nålfria tekniker har fastställts för epidermal DNA-överföring 3, 4. DNA i lösning eller associerad med katjoniska liposomer eller adenovirusvektorer har direkt appliceras på epidermis modifierade med tekniker såsom avlägsnande av stratum corneum eller behandlingen med depilating reagens. Avlägsnande av den förhornade epitelet underlättar DNA korsar den epidermala barriären och interaktion med keratinocyter och Langerhans-celler för att inducera immunsvar 5. Medan en stor yta är tillgänglig för DNA överföring och detta tillvägagångssätt inte innebär nålar, det finns nackdelar inklusive kravetför de stora kvantiteter av DNA (10-100 ng), hård behandling på huden genom strippning, och motsägande resultat i att inducera immunsvar i de immuniserade djuren utan DNA leverans booster 6. Mikropartikel-medierad intracellulär tillförsel av naket DNA till huden har visat sig vara mycket effektiv och reproducerbar för att inducera immunsvar 7, 8. En handhållen genkanon har använts för att bombardera målstället huden med plasmid DNA-belagda guldpartiklar 2 um diameter i storlek med hjälp av trycksatt helium luftflödes 9. Plasmid-DNA antagligen tas upp av KCsand dendritiska celler (DC) i huden och proteinet lokalt uttryckta eller transporteras till dränerande lymfkörtlar från DCs 10. Även om genkanon systemet är enkelt och kräver begränsad teknisk erfarenhet, kostnaden för att förbereda och leverera "DNA-bullåt "(dvs guldpulver, heliumgaser) och för genkanonen själv har begränsat dess allmänna tillämpning. Dessutom kravet på en heliumgas avgivningssystem begränsar enkel genpistol transport när experimenten utförs på olika platser. Microseeding har visats för att uppnå en högre effektivitet av genöverföring än enda injektion och partikelbombardemang 11. Microseeding använder en tatuering pistol för att leverera DNA till huden utan användning av partikelpärlor 11. Oscillerande mikronålarna på huden med användning av detta tillvägagångssätt är sannolikt att direkt skrapa cellmembranet och sålunda överföra DNA till flera celler samtidigt. emellertid är smärta i samband med det stora antalet injektioner med 0,254 nålar mm diameter en nackdel.
Här ger vi ett alternativ till DNA-leverans in vivo. Den "acufection" </strong> protokoll vi beskrivs här tillhandahåller ett ekonomiskt och effektivt sätt att leverera plasmid-DNA i mushud. I korthet, tio akupunkturnålar (0,2 mm i diameter x 13 mm längd) bunden i en bundle av tejp. En volym av 10 | il PBS med 10 ^ g av plasmid-DNA innehållande transgenen av intresse placerades på den rakade, hårborttagningskräm behandlad flank hud. Med hjälp av akupunkturnål knippet att oscillera ytan (1 cm x 1 cm) i huden, de keratiner på hornlagret lossade och plasmid-DNA anbringas på ytan absorberades in i epidermis. Hudskador övervakades och befanns vara minimal. Expression av den transfekterade genen i acufected huden bekräftades genom både kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) och ELISA. Immunmodulerande effekter av acufection levererade IL-15ΔE7 vid kutan inflammation demonstrerades med användning av IMQ behandlade musmodell 12. Medan acufection visar sig vara ett enkelt och mindre demaENDE metod för DNA-leverans in vivo, den optimala mängden av DNA för olika gener och tiderna att sticka huden måste vara noggrant optimerade för att erhålla reproducerbara resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiska steget för att säkerställa uttryck av den acufected plasmid-DNA är att jämnt oscillera och lossa hornlagret i huden. Samtidigt som du trycker nålarna försiktigt utan att skära huden, bör kraften vara tillräckligt hårt för att trycka ytan. För att underlätta absorption av DNA i 10 mikroliter lösning på en 1 cm x 1 cm ytarea, bör nålarna oscillera upp-och-ner i ca 100 gånger i 30 s. Man kan bestämma den kraft som behöver sticka huden och genom att notera hur många gånger som behöv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av anslag från ministeriet för vetenskap och teknologi (MOST 103-2633-B-002 till 002; 104 till 2320-B-002 till 048). Vi tackar Dr.. Betty Wu-Hsieh och Chien-Kuo Lee på NTU, Leigh Zerboni vid Stanford University och Dr. Peter Hoffmann vid University of Hawaii för att läsa manuskriptet, Yun Chien på NTU för tekniskt stöd, och Dr. Wen-Chi Wei på jordbruk bioteknik Research Center vid Academia Sinica för teknisk rådgivning.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
