En mångsidig Monteringsmetod för Long Term avbildning av zebrafisk utveckling

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebrafisk embryon erbjuder en idealisk experimentellt system för att studera komplexa morfogenetiska processer på grund av sin lättillgänglighet och optisk transparens. I synnerhet, är bakre kropp förlängning en viktig process i embryonal utveckling genom vilken flera vävnads deformationer agera tillsammans för att styra bildandet av en stor del av kroppen axeln. I syfte att observera denna process genom långsiktiga tidsförlopp avbildning är det nödvändigt att utnyttja en monteringsteknik som gör att tillräckligt stöd för att hålla prover i rätt orientering under överföring till mikroskopet och förvärvet. Dessutom måste monteringen också ge tillräcklig rörelsefrihet för utväxt av den bakre kroppsområdet utan att påverka dess normala utveckling. Slutligen måste det finnas en viss grad i mångsidigheten hos monteringsmetod för att möjliggöra avbildning på olika avbildnings uppställningar. Här presenterar vi en monteringsteknik för avbildning av utvecklingen av bakre kroppen elongation i zebrafisk D. rerio. Denna teknik innebär att montera embryon så att huvudet och gulesäcken regioner nästan helt ingår i agaros, medan ut den bakre kroppsområdet för att förlänga och utvecklas normalt. Vi kommer att visa hur detta kan anpassas för upprätt, inverterad och vertikala ljus ark mikroskopi uppställningar. Även om detta protokoll är inriktat på monterings embryon för bildframställning för den bakre kroppen, kan det enkelt anpassas för den levande avbildning av multipla aspekter av zebrafisk utveckling.

Introduction

Posterior kroppen töjning är en viktig process i embryonal utveckling, genom vilken embryot sträcker att bilda en stor del av kroppen axel. Det är ett exempel på en komplex morfogenetiska process genom vilken flera cell beteenden agera koordinerat att generera morfogenes på de enskilda vävnader. Dessa differential vävnad deformationer sedan agera tillsammans för att generera förlängningen av den bakre kroppen på hela strukturen nivå. För att förstå hur dessa processer styrs och samordnas under utveckling, måste vi kunna följa dessa processer på flera skalor (dvs. i nivå med molekyler, celler, populationer och vävnader cell) och relatera detta direkt till morfogenes av hela strukturen .

Zebrafisk embryon är idealiska för avbildning bakre kropp förlängning som deras optiska transparens och liten storlek gör det möjligt att tillämpa minimalinvasiv ljus avbildning väl lämpad för live avbildning. ¹ Detta har bevisats genom en rad av de senaste publikationer som har belyst bakre kroppens utveckling i nivå med molekyler, ² enskilda celler, ³ och intervävnads beteenden, ⁴ samt på graden av cellpopulationen och hela organ. ⁵

Avancerad avbildningstekniker såsom konfokal, multifoton mikroskopi och selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM) aktiverar den långsiktiga avbildning av utvecklingsprocesser med minskad effekt av ljus toxicitet och fotoblekning. Robusta tekniker för montering av levande prover krävs för att uppnå tre mål: 1) tillräckligt stöd för att hålla prover i rätt orientering under överföring till mikroskopet och under förvärv, 2) tillräcklig rörelsefrihet av provet för att medge utväxt av den bakre kroppsområdet utan att påverka dess normala develling, och slutligen 3) en viss grad i mångsidigheten hos monteringsmetod för att möjliggöra avbildning på olika avbildnings uppställningar.

Detta protokoll introducerar en monteringsteknik för avbildning utveckling av zebrafisk D. rerio. Denna teknik innebär att montera embryon så att huvudet och gulesäcken regioner nästan helt i agaros, medan den bakre kroppsområdet för att förlänga och utvecklas normalt. Som sådan, är det också en lämplig metod för den långsiktiga avbildning av andra regioner i utvecklings kroppen som agarosen möjliggör avbildning av standardljusavbildningstekniker. Detta protokoll visar montering av embryon i en lateral riktning, även om det är också möjligt att montera embryon i alterative orienteringar. Det kommer vidare att visa hur man kan anpassa metoden för upprätt, inverterade och vertikala ljus ark mikroskopi inställningar.

Protocol

1. Beredning av lösningar och dras glas Needle Gör en 25x förrådslösning av Tricaine (3-aminobensoesyra-etylester, även kallad etyl 3-aminobensoat) vid 4 mg / ml i 20 mM Tris pH 8,8 och föra denna lösning är vid pH 7. Alikvot av 4 ml och förvara vid -20 ° C. OBS: bedövningsmedel Tricaine verkar företrädesvis på neurala spänningskänsliga natriumkanaler och därmed blockerar muskelryckningar och rörelse sex. Gör ett arbetslösning av Tricaine vid en sl…

Representative Results

Det protokoll som beskrivs ovan anger en mångsidig teknik för montering av zebrafiskembryon för långvarig tidsförlopp avbildning. Ett exempel på detta visas i Figur 2A och i animerade / video Figur 1. Embryon injicerades vid en cellstadiet med mRNA som kodar för photoconvertible fluorescerande proteinet kikumeGR. Vid 15 somit stadiet var de monterade såsom beskrivits ovan och avbildas i 12 h på ett inverterat konfokalmikroskop med ett 10X objekt…

Discussion

Denna monteringsteknik gör det möjligt för embryon hållas stilla under överföring till mikroskop och över långa tidsförlopp imaging experiment som syftar till följande bakre kroppen töjning vid flera längdskalor. Dessutom är den mångsidig i att det möjliggör för avbildning på både upprätt och inverterad mikroskopi uppställningar, och ett förslag görs för hur detta kan ytterligare anpassas till vertikalt orienterad SPIM.

Ett kritiskt steg i detta protokoll är noggrann…

Materials

CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo