Summary

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Published: January 26, 2017
doi:

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebravisembryo's vormen een ideale experimenteel systeem om complexe morfogenetische processen te bestuderen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid en optische transparantie. Vooral achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling waarbij meerdere weefsel vervormingen werken samen om de vorming van een groot deel van de lichaamsas sturen. Om dit proces te observeren door langdurige time-lapse imaging moet een bevestigingstechniek waarmee voldoende steun monsters in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en verkrijging gebruiken. Daarnaast moet de montage ook voldoende bewegingsvrijheid voor de uitgroei van de achterste lichaamsgebied zonder aantasting van de normale ontwikkeling. Tenslotte moet een zekere veelzijdigheid van de montagewijze beeldvormende worden vrijgemaakt voor diverse imaging setups. Hier presenteren we een bevestigingstechniek voor beeldvorming van de ontwikkeling van achterste lichaam elongation in de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl de achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. We zullen zien hoe dit kan worden aangepast voor rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie set-ups. Hoewel dit protocol is gericht op montage embryo's voor beeldverwerking met het achterste lichaam, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de live imaging meerdere aspecten van zebravis ontwikkeling.

Introduction

Achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling van het embryo zich een groot deel van de lichaamsas vormen. Het is een voorbeeld van een complex morfogenetisch proces waardoor meercellige gedrag optreden coördinerend de morfogenese op het niveau van afzonderlijke weefsels genereren. Deze differentiële weefsel vervormingen dan samenwerken om de verlenging van het achterste lichaam te genereren in de hele structuur niveau. Om te begrijpen hoe deze processen worden aangestuurd en gecoördineerd tijdens de ontwikkeling, moeten we in staat zijn om deze processen op verschillende schalen te volgen (dat wil zeggen op het niveau van moleculen, cellen, celpopulaties en weefsels) en deze rechtstreeks verband houden met de morfogenese van de gehele structuur .

Zebravis embryo's zijn ideaal voor imaging achterste lichaam rek als hun optische transparantie en de geringe afmetingen zorgt voor de toepassing van minimaal invasieve licht imaging benaderingen zeer geschikt voor live beeldvorming. 1 Dit werd aangetoond door een aantal recente publicaties die gebleken werpen op achterste lichaam ontwikkeling op moleculair niveau, 2 enkele cellen, 3 en inter-weefsel gedrag, 4 en op het niveau van de celpopulatie en hele organen. 5

Geavanceerde imaging technieken zoals confocale, multi-foton microscopie en selectieve vliegtuig verlichting microscopie (SPIM) worden waardoor de lange termijn beeldvorming van ontwikkelingsprocessen met een verminderde werking van het licht toxiciteit en foto-bleken. Robuuste technieken voor de bevestiging van levende monsters nodig heeft drie doelen: 1) voldoende steun aan de bemonsteringen in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en tijdens acquisitie, 2) voldoende bewegingsvrijheid van het monster om de uitgroei van het achterste lichaam regio zonder dat zijn normale ontwikwikkeling, en tenslotte 3) een zekere mate van veelzijdigheid van de montage-methode om imaging staan ​​op diverse imaging set-ups.

Dit protocol introduceert een bevestigingstechniek voor het afbeelden van de ontwikkeling van de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl het achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. Als zodanig is het ook een geschikte methode voor de lange termijn beeldvorming van andere delen van het lichaam ontwikkelen als agarose maakt beeldvormend standaardfitting beeldvormingstechnieken. Dit protocol demonstreert montage van embryo's in een zijwaartse richting, maar het is ook mogelijk om embryo's in alteratieve oriëntaties monteren. Het zal verder zien hoe u de methode voor het rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie opstellingen aan te passen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Solutions en trok glazen naald Wordt 25x voorraadoplossing van tricaïne (3-amino benzoëzuurethylester, ook wel ethyl 3-aminobenzoaat) en 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 en breng deze oplossing bij pH 7. Aliquot van 4 ml en bewaar bij -20 ° C. LET OP: De verdoving tricaïne werkt bij voorkeur op neurale-voltage-gated natriumkanalen waardoor spiertrekkingen en beweging 6 blokkeren. Maak een werkoplossing van tricaïne bij een uiteindelijke conce…

Representative Results

Het protocol hierboven geschetste Gegevens een veelzijdige techniek voor de montage van de zebravis embryo's voor de lange termijn time lapse imaging. Een voorbeeld hiervan wordt getoond in figuur 2A en geanimeerde / video Figuur 1. Embryo's werden geïnjecteerd op de 1 cellig stadium met mRNA dat codeert voor het fluorescerende eiwit photoconvertible kikumeGR. Aan het 15 somiet fase werden zij geplaatst zoals hierboven beschreven en afgebeeld ge…

Discussion

Deze montage techniek maakt het mogelijk embryo's nog steeds tijdens de overdracht aan de microscoop en op lange termijn time-lapse imaging experimenten gericht op het volgende achterste lichaam rek bij meerdere lengteschalen worden gehouden. Bovendien is veelzijdig doordat het zorgt voor beeldvorming zowel rechtop en ondersteboven microscopie opstellingen en een suggestie gedaan voor hoe dit verder kan worden aangepast om verticaal georiënteerde SPIM.

Een kritische stap in dit protocol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

Materials

CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes Mattek P35-1.5-10-C 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles  Sutter  BF 120-94-10 We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel Feather P-715 Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes 230 mm long
REAGENTS
Tricaine Sigma-Aldrich A5040
Low-melting point agarose Sigma-Aldrich A9414
EQUIPMENT
Fine forceps  FINE SCIENCE TOOLS GMBH  11252-30  Dumont #5
Needle puller  Sutter  P97 Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope Leica S8 Apo

References

  1. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
  2. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  3. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  4. Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
  5. Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
  6. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
  7. Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  8. Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
  9. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
  10. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Play Video

Cite This Article
Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (119), e55210, doi:10.3791/55210 (2017).

View Video